304 اسٽينلیس سٹیل ڪوئل ٽيوبنگ ڪيميائي جزو، SPACA6 ectodomain جي جوڙجڪ گيمٽ فيوزن سان لاڳاپيل پروٽينن جي محفوظ ڪيل سپر فيملي تي مشتمل آهي.

Nature.com گهمڻ لاءِ توهان جي مهرباني.توھان استعمال ڪري رھيا آھيو برائوزر ورزن محدود CSS سپورٽ سان.بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي بند ڪريو).اضافي طور تي، جاري مدد کي يقيني بڻائڻ لاء، اسان سائيٽ کي بغير اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ ڏيکاريون ٿا.
سلائڊر ڏيکاريندڙ ٽي مضمون في سلائڊ.سلائڊ ذريعي منتقل ڪرڻ لاء پوئتي ۽ ايندڙ بٽڻ استعمال ڪريو، يا هر سلائڊ ذريعي منتقل ڪرڻ لاء آخر ۾ سلائڊ ڪنٽرولر بٽڻ استعمال ڪريو.

SPACA6 هڪ سپرم-ظاهر ڪيل سطحي پروٽين آهي جيڪو مامرن جي جنسي پيدائش دوران گيمٽ فيوزن لاءِ نازڪ آهي.ھن بنيادي ڪردار جي باوجود، SPACA6 جي مخصوص فنڪشن کي خراب سمجھيو ويو آھي.اسان 2.2 Å جي ريزوليوشن تي SPACA6 جي extracellular ڊومين جي ڪرسٽل ڍانچي کي واضح ڪريون ٿا، هڪ ٻن ڊومين پروٽين کي ظاهر ڪري ٿو جيڪو چار-اسٽرينڊ بنڊل ۽ Ig-like β-sandwiches تي مشتمل آهي، جيڪو اڌ-لچڪدار لنڪرز سان شامل آهي.هي ڍانچو IZUMO1 سان مشابهت رکي ٿو، هڪ ٻي گيمٽ فيوزن سان لاڳاپيل پروٽين، SPACA6 ۽ IZUMO1 کي ڀاڻڻ سان لاڳاپيل پروٽين جي سپر فيملي جا باني ميمبر ٺاهيندي جنهن کي هتي IST سپر فيملي طور حوالو ڏنو ويو آهي.IST سپر فيملي ساخت جي وضاحت ڪئي وئي آهي ان جي ٽوڙيل چار-هيلڪس بنڊل ۽ ڊسلفائيڊ سان ڳنڍيل CXXC نقشن جو هڪ جوڙو.انساني پروٽوم جي هڪ ساخت جي بنياد تي الفا فولڊ ڳولا هن عظيم خاندان جي اضافي پروٽين ميمبرن جي نشاندهي ڪئي؛خاص طور تي، انهن مان ڪيترائي پروٽين گيمٽ فيوزن ۾ شامل آهن.SPACA6 جو ڍانچو ۽ ان جو تعلق IST جي ٻين ميمبرن سان وڏي خانداني طور تي اسان جي علم ۾ مليل ڪڙي مهيا ڪري ٿو ماملين گيمٽ فيوزن جي.
هر انسان جي زندگيءَ جي شروعات ٻن جدا جدا هيپلوڊ گيمٽس سان ٿيندي آهي: پيءُ جو سپرم ۽ ماءُ جو آنو.هي سپرم هڪ شديد انتخاب جي عمل جو فاتح آهي جنهن دوران لکين سپرم سيلز عورتن جي جينياتي رستي مان گذري ٿو، مختلف رڪاوٽن کي پار ڪري ٿو ۽ ڪيپيسيٽيشن (Capacitation) مان گذري ٿو، جيڪو انهن جي حرڪت ۽ سطح جي اجزاء جي عمل کي وڌائي ٿو 2,3,4.جيتوڻيڪ سپرم ۽ oocyte هڪ ٻئي کي ڳولي، اهو عمل اڃا ختم نه ٿيو آهي.oocyte cumulus Cells جي هڪ پرت ۽ گلائڪوپروٽين جي رڪاوٽ سان گھريل آهي جنهن کي زونا پيلوسيڊا سڏيو ويندو آهي، جنهن ذريعي سپرم کي oocyte ۾ داخل ٿيڻ لاءِ گذرڻو پوندو آهي.Spermatozoa انهن آخري رڪاوٽن کي پار ڪرڻ لاءِ مٿاڇري جي ملندڙ ماليڪيولز ۽ جھلي سان لاڳاپيل ۽ ڳجهي انزائمز جو مجموعو استعمال ڪندو آهي 5.اهي ماليڪيولز ۽ اينزائمز بنيادي طور تي اندرين جھلي ۽ ايڪروسومل ميٽرڪس ۾ محفوظ ٿين ٿا ۽ ان وقت معلوم ٿين ٿا جڏهن سپرم جي ٻاهرئين جھلي کي ايڪروسومل ردعمل دوران لڪايو وڃي ٿو.هن شديد سفر جو آخري مرحلو سپرم-ايگ فيوزن وارو واقعو آهي، جنهن ۾ ٻه خانا پنهنجي ميمبرن کي فيوز ڪري هڪ واحد ڊپلوڊ آرگنزم7 بڻجي ويندا آهن.جيتوڻيڪ اهو عمل انساني پيدائش ۾ اهم آهي، ضروري ماليڪيولر تعامل خراب سمجهي رهيا آهن.
گيميٽس جي ڀاڻڻ کان علاوه، ٻن لپيد بائليئرز جي فيوزن جي ڪيميا جو وسيع اڀياس ڪيو ويو آهي.عام طور تي، ميبرين فيوزن هڪ توانائيءَ سان ناڪاري عمل آهي، جنهن لاءِ هڪ پروٽين ڪيٽيلسٽ جي ضرورت هوندي آهي ته جيئن هڪ ساخت جي تبديليءَ ۾ اچي، جيڪا ٻن جھلين کي هڪ ٻئي جي ويجهو آڻي، انهن جي تسلسل کي ٽوڙيندي ۽ 8,9 فيوزن جو سبب بڻجي ٿي.اهي پروٽين ڪيٽالسٽس کي fusogens طور سڃاتو وڃي ٿو ۽ بيشمار فيوزن سسٽم ۾ مليا آهن.اهي ميزبان سيلز ۾ وائرل داخل ٿيڻ لاءِ گهربل آهن (مثال طور، ايڇ آءِ وي-1 ۾ gp160، ڪورون وائرس ۾ اسپائڪ، انفلوئنزا وائرس ۾ هيماگلوٽينين) 10,11,12 پلاسينٽل (سنسيٽين) 13,14,15 ۽ هيٺين يوڪريوٽس ۾ گيميٽ ٺاهڻ واري فيوزن ( HAP2/GCS1 ٻوٽن، پروٽسٽس ۽ آرٿروپوڊس ۾) 16,17,18,19.انساني گيمٽس لاءِ Fusogens اڃا تائين دريافت ڪيا ويا آهن، جيتوڻيڪ ڪيترن ئي پروٽينن کي گيميٽ منسلڪ ۽ فيوزن لاء نازڪ ڏيکاريو ويو آهي.oocyte-expressed CD9، هڪ transmembrane پروٽين آهي جيڪو مائوس ۽ انساني گيمٽس جي فيوزن لاءِ گهربل آهي، پهريون ڀيرو 21,22,23 دريافت ڪيو ويو.جيتوڻيڪ ان جو درست ڪم واضح ناهي رهيو، چپن ۾ هڪ ڪردار، ايگ مائڪروويلي تي آسنجن فوسي جي جوڙجڪ، ۽ / يا oocyte مٿاڇري جي پروٽين جي صحيح لوڪلائيزيشن لڳي ٿي 24,25,26.ٻه سڀ کان وڌيڪ عام پروٽين جيڪي گيمٽ فيوزن لاءِ نازڪ آهن سپرم پروٽين IZUMO127 ۽ oocyte پروٽين JUNO28 آهن، ۽ انهن جو باهمي تعلق هڪ اهم قدم آهي گيميٽ جي سڃاڻپ ۽ فيوزن کان اڳ Adhesion ۾.نر Izumo1 knockout مائوس ۽ مادي جونو ناڪ آئوٽ چوها مڪمل طور تي جراثيم کان پاڪ هوندا آهن، انهن ماڊلز ۾ اسپرم پيريويٽيلين اسپيس ۾ داخل ٿيندا آهن پر گيمٽس فيوز نه ٿيندا آهن.اهڙي طرح، سنگم گهٽجي ويو جڏهن گيميٽس کي اينٽي IZUMO1 يا JUNO27,29 اينٽي باڊيز سان انساني ان ويٽرو ڀاڻ جي تجربن ۾ علاج ڪيو ويو.
تازو، IZUMO1 ۽ JUNO20,30,31,32,33,34,35 سان مشابهت رکندڙ اسپرم ايڪسپريس پروٽينن جو هڪ نئون دريافت ڪيل گروپ دريافت ڪيو ويو آهي.اسپرم ايڪروسومل جھلي سان لاڳاپيل پروٽين 6 (SPACA6) کي وڏي پيماني تي مورين ميوٽيجنيسس مطالعي ۾ ڀاڻ لاء ضروري طور سڃاتو ويو آهي.Transgene کي Spaca6 جين ۾ داخل ڪرڻ سان نان فيوزبل اسپرماتوزوا پيدا ٿئي ٿو، جيتوڻيڪ اهي اسپرماٽوزا پريوٽيلائن اسپيس 36 ۾ داخل ٿين ٿا.چوٿين ۾ بعد ۾ نڪرندڙ مطالعي جي تصديق ڪئي وئي آهي ته Spaca6 جي ضرورت آهي گيمٽ فيوزن 30,32 لاء.SPACA6 تقريبن خاص طور تي ٽيسٽن ۾ ظاهر ڪيو ويو آهي ۽ IZUMO1 وانگر هڪ لوڪلائيزيشن نمونو آهي، يعني ايڪروسومل ردعمل کان اڳ اسپرماتوزوا جي انٽيما جي اندر، ۽ پوء ايڪروسومل ردعمل 30,32 کان پوء خط استوا واري علائقي ڏانهن لڏپلاڻ ڪري ٿو.Spaca6 homologues مختلف مامرن ۽ ٻين eukaryotes 30 ۾ موجود آهن ۽ انساني گيميٽ فيوزن لاءِ ان جي اهميت کي ظاهر ڪيو ويو آهي ويٽرو ۾ انساني ڀاڻ کي روڪيندي SPACA6 30 جي مزاحمت ذريعي.IZUMO1 ۽ JUNO جي برعڪس، SPACA6 جي ڍانچي، تعاملات، ۽ ڪم جا تفصيل واضح ناهن.
انساني اسپرم ۽ انڊس جي فيوزن جي بنيادي عمل کي بهتر سمجھڻ لاءِ، جيڪو اسان کي خانداني منصوبابندي ۽ زرخيزي جي علاج ۾ مستقبل جي ترقيات کي آگاهي ڏيڻ جي قابل بڻائيندو، اسان SPACA6 ساختي ۽ بايو ڪيميڪل اڀياس ڪيا.SPACA6 جي extracellular ڊومين جي ڪرسٽل ڍانچي هڪ چار-هيليڪل بنڊل (4HB) ۽ هڪ اميونوگلوبولين جهڙو (Ig-like) ڊومين ڏيکاري ٿو جيڪو اڌ لچڪدار علائقن سان ڳنڍيل آهي.جيئن اڳئين اڀياس ۾ اڳڪٿي ڪئي وئي آهي، 7,32,37 SPACA6 جي ڊومين ڍانچي انساني IZUMO1 جي برابر آهي، ۽ ٻه پروٽين هڪ غير معمولي نموني سان حصيداري ڪن ٿا: 4HB هڪ ٽڪنڊي هيليڪل سطح سان ۽ ڊسلفائيڊ سان ڳنڍيل CXXC نقشن جو هڪ جوڙو.اسان تجويز ڪريون ٿا ته IZUMO1 ۽ SPACA6 هاڻي وضاحت ڪريون ٿا هڪ وڏو، ساخت جي لحاظ سان جڙيل پروٽينن جي وڏي خانداني طور تي جڙيل گيمٽ فيوزن سان.سپر فيملي لاءِ منفرد خصوصيتن کي استعمال ڪندي، اسان الفا فولڊ جي ڍانچي انساني پروٽوم لاءِ مڪمل ڳولا ڪئي، جنهن ۾ هن سپر فيملي جي اضافي ميمبرن جي نشاندهي ڪئي وئي، جن ۾ ڪيترائي ميمبر شامل آهن جيڪي گيمٽ فيوزن ۽/يا ڀاڻ ۾ شامل آهن.اهو هاڻي ظاهر ٿئي ٿو ته اتي هڪ عام ڍانچي فولڊ آهي ۽ پروٽينن جي وڏي خانداني طور تي گيمٽ فيوزن سان لاڳاپيل آهي، ۽ اسان جي جوڙجڪ انساني گيمٽ فيوزن ميڪانيزم جي هن اهم پهلو جو هڪ سالماتي نقشو مهيا ڪري ٿي.
SPACA6 هڪ واحد پاس ٽرانسميبرن پروٽين آهي جنهن ۾ هڪ اين-منسلڪ گلائڪن ۽ ڇهه پوٽيٽيو ڊسلفائيڊ بانڊ (فگرز S1a ۽ S2) آهن.اسان ڊروسوفلا S2 سيلز ۾ انساني SPACA6 (residues 27-246) جي extracellular ڊومين جو اظهار ڪيو ۽ nickel affinity، cation exchange، ۽ size exclusion chromatography (Fig. S1b) استعمال ڪندي پروٽين کي صاف ڪيو.صاف ٿيل SPACA6 ectodomain تمام مستحڪم ۽ هڪجهڙائي آهي.سائيز جي خارج ڪرڻ واري ڪروميٽوگرافي کي استعمال ڪندي تجزيو پوليگونل لائٽ اسڪريرنگ (SEC-MALS) سان گڏ هڪ چوٽي ظاهر ڪئي وئي جنهن ۾ 26.2 ± 0.5 kDa (تصوير S1c) جي حسابي ماليڪيولر وزن سان.اهو SPACA6 monomeric ectodomain جي سائيز سان مطابقت رکي ٿو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته oligomerization صاف ڪرڻ دوران نه ٿيو.ان کان علاوه، سرڪيولر ڊيڪروزم (سي ڊي) اسپيڪٽرو اسڪوپي ظاهر ڪيو هڪ مخلوط α/β ڍانچي 51.3 °C جي پگھلڻ واري نقطي سان (Fig. S1d,e).سي ڊي اسپيڪٽرا جي ڊيڪونوليشن 38.6٪ α-helical ۽ 15.8٪ β-stranded عناصر (Figure S1d) ظاهر ڪيو.
SPACA6 ectodomain بي ترتيب ميٽرڪس سيڊنگ 38 استعمال ڪندي ڪرسٽل ڪيو ويو جنهن جي نتيجي ۾ 2.2 Å جي ريزوليوشن سان ڊيٽا سيٽ (ٽيبل 1 ۽ شڪل S3).ٽڪڙي جي بنياد تي ماليڪيولر متبادل ۽ SAD فيزنگ ڊيٽا جي ميلاپ کي استعمال ڪندي برومائيڊ جي نمائش سان گڏ ساخت جي طئي ڪرڻ لاءِ (ٽيبل 1 ۽ شڪل S4)، آخري سڌريل ماڊل 27-246 جي باقيات تي مشتمل آهي.جنهن وقت ڍانچي جو تعين ڪيو ويو، اتي ڪو به تجرباتي يا الفا فولڊ ڍانچو موجود نه هو.SPACA6 ectodomain 20 Å × 20 Å × 85 Å ماپن تي مشتمل آهي، ست هيليڪس ۽ نو β-اسٽينڊن تي مشتمل آهي، ۽ هڪ ڊگهو ٽيٽيري فولڊ آهي جيڪو ڇهن ڊسلفائيڊ بانڊز (تصوير 1a، b) سان مستحڪم آهي.Asn243 پاسي واري زنجير جي آخر ۾ ڪمزور اليڪٽران جي کثافت ظاهر ڪري ٿي ته هي رهجي ويل هڪ N-linked glycosylation آهي.ساخت ٻن ڊومينز تي مشتمل آھي: ھڪ N-ٽرمينل چار-ھيلڪس بنڊل (4HB) ۽ ھڪڙو C-ٽرمينل Ig- جھڙو ڊومين انھن جي وچ ۾ وچ واري ھنج واري علائقي سان (تصوير 1c).
SPACA6 جي extracellular ڊومين جو هڪ ڍانچو.SPACA6 جي extracellular ڊومين جي پٽي ڊاگرام، زنجير جو رنگ N کان C-ٽرمينس کان ڳاڙهو نيري کان ڳاڙهو ڳاڙھو.ڊسلفائيڊ بانڊ ۾ شامل ڪيل سيسٽائن کي ميگنٽا ۾ نمايان ڪيو ويو آهي.b SPACA6 جي extracellular ڊومين جي Topology.ساڳيو رنگ اسڪيم استعمال ڪريو جيئن تصوير 1a ۾.c SPACA6 extracellular ڊومين.4HB، هنج، ۽ Ig-جهڙوڪ ڊومين پٽي چارٽ رنگا رنگ آهن نارنگي، سائو، ۽ نيري، ترتيب سان.پرت پيماني تي ٺهيل نه آهن.
SPACA6 جي 4HB ڊومين ۾ چار مکيه هيليڪس (هيليڪس 1-4) شامل آهن، جيڪي ترتيب ڏنل هيليڪل هيلڪس (Fig. 2a) جي صورت ۾ آهن، متوازي ۽ متوازي رابطي جي وچ ۾ متبادل (Fig. 2b).هڪ ننڍڙو اضافي سنگل ٽرن هيلڪس (هيلڪس 1′) بنڊل جي سامهون رکيل آهي، هيلڪس 1 ۽ 2 سان هڪ ٽڪنڊو ٺاهي ٿو. هي ٽڪنڊي هيليڪس 3 ۽ 4 جي نسبتا گھڻ واري پيڪنگ جي هيليڪل-ٽوسٽڊ پيڪنگ ۾ ٿوري خراب ٿيل آهي ( تصوير 2a).
4HB N-ٽرمينل پٽي چارٽ.b چار هيليڪس جي بنڊل جو مٿيون نظارو، هر هيلڪس N-ٽرمينس تي ڳاڙهي نيري ۽ سي-ٽرمينس تي ڳاڙهي ڳاڙهي ۾ نمايان ٿيل آهي.c 4HB لاءِ ٽاپ-ڊائون اسپرل ويل ڊاگرام، هر رهجي ويل دائري طور ڏيکاريل آهي هڪ واحد اکر امينو ايسڊ ڪوڊ سان؛صرف چار امينو اسيدن کي ڳڻپيو ويو آهي جن جي چوٽيءَ تي آهي.غير قطبي رهجي ويل رنگ پيلو آهن، پولر غير چارج ٿيل رهجي ويل رنگ وارا سائو آهن، مثبت طور تي چارج ٿيل بقايا رنگا نيري آهن، ۽ منفي طور تي چارج ٿيل بقايا رنگا رنگا آهن.d 4HB ڊومين جا ٽڪنڊي منھن، 4HB نارنگي ۾ ۽ ڪنگ سائي ۾.ٻئي انسٽس ڏيکارين ٿا ڇنڊن جي شڪل واري ڊسلفائيڊ بانڊ.
4HB هڪ اندروني هائيڊروفوبڪ ڪور تي مرڪوز آهي جنهن ۾ خاص طور تي aliphatic ۽ خوشبودار رهجي ويا آهن (Fig. 2c).ڪور Cys41 ۽ Cys55 جي وچ ۾ ڊسلفائيڊ بانڊ تي مشتمل آهي جيڪو هيليڪس 1 ۽ 2 کي هڪ مٿئين اڀريل ٽڪنڊي (Fig. 2d) ۾ ڳنڍي ٿو.هيلڪس 1′ ۾ CXXC motif جي وچ ۾ ٻه اضافي ڊسلفائيڊ بانڊ ٺاهيا ويا ۽ هڪ ٻيو CXXC نقشو هنج علائقي ۾ β-هيئرپن جي ٽپ تي مليو (تصوير 2d).اڻڄاتل فعل (Arg37) سان گڏ هڪ قدامت پسند ارجنائن ريزيڊيو هڪ ٿلهي مثلث جي اندر واقع آهي جيڪو هيليڪس 1′، 1، ۽ 2 سان ٺهيل آهي. اليفاٽڪ ڪاربان ايٽمس Cβ، Cγ، ۽ Cδ Arg37 هائيڊروفوبڪ ڪور سان رابطو ڪن ٿا، ۽ ان جا گيانڊين گروپ سائيڪل طور حرڪت ڪن ٿا. هيليڪس 1′ ۽ 1 جي وچ ۾ Thr32 ريبون ۽ پاسي واري زنجير جي وچ ۾ رابطي جي ذريعي (Fig. S5a,b).Tyr34 گفا ۾ وڌندو آهي ٻه ننڍڙا گفا جن جي ذريعي Arg37 محلول سان رابطو ڪري سگهي ٿو.
Ig-like β-sandwich ڊومينز پروٽينن جو ھڪڙو وڏو خاندان آھي جيڪو ٻن يا وڌيڪ گھڻن-اسٽرينڊڊ amphipathic β-sheets جي گڏيل خصوصيت کي ھڪڙي ھائيڊروفوبڪ ڪور 39 ذريعي ڳنڍي ٿو. SPACA6 جو C-ٽرمينل Ig- جھڙو ڊومين ساڳيو نمونو آھي. ۽ ٻن تہن تي مشتمل آھي (تصوير S6a).شيٽ 1 هڪ β-شيٽ آهي چار اسٽريڊس (اسٽينڊس ڊي، ايف، ايڇ ۽ آء) جتي اسٽرينڊز F، H، ۽ I هڪ متوازي متوازي ترتيب ٺاهيندا آهن، ۽ اسٽرينڊ I ۽ D هڪ متوازي رابطي تي وٺن ٿا.جدول 2 ھڪڙو ننڍڙو مخالف متوازي ڊبل اسٽرينڊ بيٽا شيٽ آھي (اسٽرينڊ E ۽ G).اي زنجير جي سي-ٽرمينس ۽ ايڇ چين جي مرڪز (Cys170-Cys226) (تصوير S6b) جي وچ ۾ هڪ اندروني ڊسلفائيڊ بانڊ ڏٺو ويو.هي ڊسلفائيڊ بانڊ 40,41 امونگلوبولين جي β-سينڊوچ ڊومين ۾ ڊسلفائيڊ بانڊ جي برابر آهي.
چار-اسٽينڊ β-شيٽ پنهنجي پوري ڊگھائي سان موڙي ٿو، غير متناسب ڪنڊن کي ٺاهي ٿو جيڪي شڪل ۽ اليڪٽررو اسٽيٽڪس ۾ مختلف آهن.ٿلهي ڪنڊ هڪ فليٽ هائڊرو فوبڪ ماحولياتي مٿاڇري آهي جيڪا SPACA6 (Fig. S6b,c) ۾ باقي اڻ برابر ۽ اليڪٽررو اسٽيٽيڪل طور تي مختلف سطحن جي مقابلي ۾ بيٺي آهي.هائيڊروفوبڪ مٿاڇري (تصوير S6c) جي چوڌاري پٺتي پيل ڪاربونيل/امينو گروپن ۽ پولر پاسي واري زنجيرن جو هڪ هالو.ويڪر مارجن هڪ ڍڪيل هيليڪل سيگمينٽ سان ڍڪيل آهي جيڪو هائيڊروفوبڪ ڪور جي N-ٽرمينل حصي کي بلاڪ ڪري ٿو ۽ ٽي هائيڊروجن بانڊ ٺاهي ٿو جنهن سان F چين جي پٺ جي هڏي جي کليل پولر گروپ (Fig. S6d).هن ڪنڊ جو سي-ٽرمينل حصو هڪ وڏو کيسي ٺاهي ٿو جيڪو جزوي طور تي ظاهر ٿيل هائيڊروفوبڪ ڪور سان.کيسي مثبت چارجن سان گھري وئي آهي ڇاڪاڻ ته ڊبل ارجنائن جي باقين جي ٽن سيٽن (Arg162-Arg221، Arg201-Arg205 ۽ Arg212-Arg214) ۽ هڪ مرڪزي هسٽيڊائن (His220) (Figure S6e).
هيليڪل ڊومين ۽ Ig-جهڙوڪ ڊومين جي وچ ۾ هنج وارو علائقو هڪ ننڍو ڀاڱو آهي، جنهن ۾ هڪ ضد متوازي ٽي-اسٽرينڊ β-پرت (اسٽينڊس A، B ۽ C)، هڪ ننڍڙو 310 هيلڪس، ۽ ڪيترائي ڊگها بي ترتيب هيليڪل حصا شامل آهن.(تصوير S7).هنج واري علائقي ۾ covalent ۽ electrostatic رابطن جو هڪ نيٽ ورڪ 4HB ۽ Ig-like ڊومين جي وچ ۾ واقفيت کي مستحڪم ڪرڻ لاءِ ظاهر ٿئي ٿو.نيٽ ورڪ کي ٽن حصن ۾ ورهائي سگهجي ٿو.پهرين حصي ۾ ٻه CXXC نقشا شامل آهن (27CXXC30 ۽ 139CXXC142) جيڪي ڊسلفائيڊ بانڊ جو هڪ جوڙو ٺاهيندا آهن β-هيئر پن جي وچ ۾ ۽ 4HB ۾ 1′ هيلڪس.ٻئي حصي ۾ Ig-like ڊومين ۽ hinge جي وچ ۾ electrostatic رابطي شامل آهن.هنج ۾ Glu132 Ig-like ڊومين ۾ Arg233 ۽ هنج ۾ Arg135 سان گڏ هڪ لوڻ وارو پل ٺاهي ٿو.ٽئين حصي ۾ Ig-like ڊومين ۽ hinge علائقي جي وچ ۾ هڪ covalent بانڊ شامل آهي.ٻه ڊسلفائيڊ بانڊ (Cys124-Cys147 ۽ Cys128-Cys153) هنج لوپ کي هڪ لنڪر سان ڳنڍيندا آهن جيڪي Gln131 ۽ پٺ جي بون فنڪشنل گروپ جي وچ ۾ اليڪٽررو اسٽيٽٽڪ رابطي ذريعي مستحڪم آهن، پهرين Ig-جهڙي ڊومين تائين رسائي جي اجازت ڏين ٿا.زنجير
SPACA6 ectodomain جي جوڙجڪ ۽ 4HB ۽ Ig-like ڊومينز جي انفرادي جوڙجڪ پروٽين ڊيٽابيس 42 ۾ ساختماني طور تي ساڳئي رڪارڊ ڳولڻ لاء استعمال ڪيا ويا.اسان ڊالي زيڊ اسڪورز، ننڍڙن معياري انحرافن، ۽ وڏي LALI اسڪور سان ميچن جي نشاندهي ڪئي (جنهن بعد ۾ ساخت جي لحاظ سان برابري جي باقيات جو تعداد).جڏهن ته مڪمل ectodomain ڳولا (ٽيبل S1) مان پهرين 10 هٽن ۾ هڪ قابل قبول Z-اسکور هو> 842، 4HB يا Ig-like ڊومين جي ڳولا اڪيلو اهو ظاهر ڪيو ته انهن مان اڪثر هٽ صرف β-sandwiches سان ملن ٿا.ڪيترن ئي پروٽينن ۾ مليا هڪ هر جڳهه.Dali ۾ سڀ ٽي ڳولها صرف هڪ نتيجو آيو: IZUMO1.
اهو ڊگهي عرصي کان تجويز ڪيو ويو آهي ته SPACA6 ۽ IZUMO1 جي جوڙجڪ جي هڪجهڙائي 7,32,37 حصيداري ڪريو.جيتوڻيڪ انهن ٻن گيمٽ فيوزن سان لاڳاپيل پروٽين جي ايڪٽو ڊومينز صرف 21٪ تسلسل جي سڃاڻپ (Figure S8a) کي حصيداري ڪن ٿا، پيچيده ثبوت، بشمول هڪ محفوظ ڊسلفائيڊ بانڊ نموني ۽ SPACA6 ۾ هڪ اڳڪٿي ڪيل سي-ٽرمينل Ig-جهڙو ڊومين، شروعاتي ڪوششن کي تعمير ڪرڻ جي اجازت ڏني. A a SPACA6 ماؤس جو هومولوجي ماڊل IZUMO1 کي ٽيمپليٽ طور استعمال ڪندي37.اسان جي جوڙجڪ انهن اڳڪٿين جي تصديق ڪري ٿي ۽ هڪجهڙائي جي حقيقي درجي کي ڏيکاري ٿي.حقيقت ۾، SPACA6 ۽ IZUMO137,43,44 جوڙجڪ ساڳيا ٻه-ڊومين آرڪيٽيڪچر (Fig. S8b) سان گڏ هڪجهڙا 4HB ۽ Ig-like β-sandwich ڊومينز سان ڳنڍيل آهن جيڪي هنج علائقي (Fig. S8c) سان ڳنڍيل آهن.
IZUMO1 ۽ SPACA6 4HB ۾ روايتي سرپل بنڊلن کان عام اختلاف آهن.عام 4HBs، جهڙوڪ SNARE پروٽين ڪمپليڪس ۾ مليا آهن جيڪي Endosomal fusion 45,46 ۾ شامل آهن، هڪجهڙا فاصلا هيليس آهن جيڪي مرڪزي محور 47 جي چوڌاري مسلسل وکر کي برقرار رکندا آهن. ان جي ابتڙ، ٻنهي IZUMO1 ۽ SPACA6 ۾ هيليڪل ڊومينز مسخ ٿيل هئا، متغير گھمڻ سان. اڻ برابر پيڪنگ (شڪل S8d).موڙ، غالباً هيليڪس 1′، 1 ۽ 2 جي ٺهيل ٽڪنڊي جي ڪري، IZUMO1 ۽ SPACA6 ۾ رکيل آهي ۽ هيلڪس 1′ تي ساڳئي CXXC موڙ سان مستحڪم آهي.جڏهن ته، SPACA6 ۾ مليل اضافي ڊسلفائيڊ بانڊ (Cys41 ۽ Cys55 covalently helices 1 ۽ 2 کي مٿي سان ڳنڍي رهيا آهن) ٽڪنڊي جي چوٽي تي هڪ تيز چوٽي ٺاهي ٿو، SPACA6 کي IZUMO1 کان وڌيڪ موڙي ٿو، وڌيڪ واضح گفا ٽڪنڊيز سان.ان کان علاوه، IZUMO1 ۾ Arg37 جو فقدان آهي جيڪو SPACA6 ۾ هن گفا جي مرڪز ۾ مشاهدو ڪيو ويو آهي.ان جي ابتڙ، IZUMO1 ۾ وڌيڪ عام هائيڊروفوبڪ بنيادي aliphatic ۽ خوشبودار رهجي ويا آهن.
IZUMO1 وٽ هڪ Ig جهڙو ڊومين آهي جنهن ۾ ڊبل اسٽرينڊ ۽ پنج اسٽرينڊ β-sheet43 شامل آهن.IZUMO1 ۾ اضافي اسٽرينڊ SPACA6 ۾ ڪوئل کي تبديل ڪري ٿو، جيڪو F اسٽرينڊ سان رابطو ڪري ٿو ته جيئن اسٽرينڊ ۾ پٺ جي بون هائڊروجن بانڊ کي محدود ڪري.مقابلي جو هڪ دلچسپ نقطو ٻن پروٽينن جي Ig-like ڊومينز جي اڳڪٿي ڪيل سطح چارج آهي.IZUMO1 مٿاڇري SPACA6 مٿاڇري کان وڌيڪ منفي طور تي چارج ٿيل آهي.هڪ اضافي چارج سي-ٽرمينس جي ويجهو واقع آهي جيڪو سپرم جھلي کي منهن ڏئي ٿو.SPACA6 ۾، ساڳيا علائقا وڌيڪ غير جانبدار يا مثبت طور تي چارج ٿيل هئا (Fig. S8e).مثال طور، SPACA6 ۾ هائيڊروفوبڪ مٿاڇري (ٿلهي ڪنڊن) ۽ مثبت طور تي چارج ٿيل پٽي (وڏيون ڪنڊون) IZUMO1 ۾ منفي طور تي چارج ٿيل آهن.
جيتوڻيڪ IZUMO1 ۽ SPACA6 جي وچ ۾ تعلق ۽ ثانوي ساخت جا عنصر چڱي طرح محفوظ آهن، Ig-like ڊومينز جي ساخت جي ترتيب ڏيکاري ٿي ته ٻئي ڊومينز هڪ ٻئي جي نسبت سان انهن جي عام واقفيت ۾ مختلف آهن (Fig. S9).IZUMO1 جو سرپل بنڊل β-sandwich جي باري ۾ مڙيو ويو آهي، مرڪزي محور کان اٽڪل 50° تي اڳ بيان ڪيل ”بومرانگ“ شڪل ٺاهي ٿو.ان جي ابتڙ، SPACA6 ۾ هيليڪل بيم اٽڪل 10 ° مخالف سمت ۾ جھڪيو ويو.ھنن رخن ۾ فرق غالباً ھنج علائقي ۾ اختلافن جي ڪري آھي.پرائمري تسلسل جي سطح تي، IZUMO1 ۽ SPACA6 ٿلهي تي هڪجهڙائي رکن ٿا، سواءِ cysteine، glycine، ۽ aspartic acid جي باقيات جي.نتيجي طور، هائيڊروجن بانڊ ۽ electrostatic نيٽ ورڪ مڪمل طور تي مختلف آهن.β-شيٽ ثانوي ساخت جا عنصر IZUMO1 ۽ SPACA6 پاران حصيداري ڪيا ويا آهن، جيتوڻيڪ IZUMO1 ۾ زنجير تمام گهڻيون آهن ۽ 310 هيلڪس (هيلڪس 5) SPACA6 کان منفرد آهي.انهن اختلافن جي نتيجي ۾ ٻن ٻي صورت ۾ هڪجهڙائي واري پروٽينن لاءِ مختلف ڊومين جارحيتون آهن.
اسان جي ڊيلي سرور جي ڳولا ۾ پڌرو ٿيو ته SPACA6 ۽ IZUMO1 صرف ٻه تجرباتي طور تي طئي ٿيل ڍانچيون آهن جيڪي پروٽين ڊيٽابيس ۾ محفوظ ڪيون ويون آهن جن وٽ هي خاص 4HB فولڊ (ٽيبل S1) آهي.تازو ئي، ڊيپ مائنڊ (Alphabet/Google) AlphaFold تيار ڪيو آهي، هڪ نيورل نيٽ ورڪ جي بنياد تي سسٽم جيڪو صحيح طور تي پروٽين جي 3D ساخت جي ابتدائي ترتيبن کان اڳڪٿي ڪري سگهي ٿو48.ٿوري دير کان پوءِ اسان SPACA6 ڍانچي کي حل ڪيو، AlphaFold ڊيٽابيس جاري ڪيو ويو، پيش گوئي ڪندڙ ڍانچي جا ماڊل مهيا ڪن ٿا 98.5٪ سڀني پروٽينن جو انساني پروٽوم 48,49 ۾.اسان جي حل ٿيل SPACA6 ڍانچي کي سرچ ماڊل جي طور تي استعمال ڪندي، AlphaFold انساني پروٽوم ۾ ماڊل لاءِ هڪ structural homology ڳولا، اميدوارن کي SPACA6 ۽ IZUMO1 سان ممڪن ساخت جي هڪجهڙائي سان سڃاڻي ٿو.SPACA6 (Fig. S10a) جي اڳڪٿي ڪرڻ ۾ AlphaFold جي ناقابل يقين درستگي کي نظر ۾ رکندي - خاص طور تي 1.1 Å rms ectodomain جي مقابلي ۾ اسان جي حل ٿيل ڍانچي (Fig. S10b) - اسان يقين ڪري سگھون ٿا ته SPACA6 جي سڃاڻپ ٿيل ميچز صحيح هجڻ جا امڪان آهن.
اڳي، PSI-BLAST ٽن ٻين سپرم سان لاڳاپيل پروٽينن سان IZUMO1 ڪلستر جي ڳولا ڪئي: IZUMO2، IZUMO3، ۽ IZUMO450.AlphaFold اڳڪٿي ڪئي آهي ته اهي IZUMO خانداني پروٽين 4HB ڊومين ۾ ساڳي ڊسلفائيڊ بانڊ جي نموني سان IZUMO1 (Figures 3a ۽ S11) سان گڏ ٿين ٿا، جيتوڻيڪ انهن وٽ Ig جهڙو ڊومين ناهي.اهو فرض ڪيو ويو آهي ته IZUMO2 ۽ IZUMO3 هڪ طرفي جھلي پروٽين آهن، جهڙوڪ IZUMO1، جڏهن ته IZUMO4 لڪايل نظر اچن ٿا.گيمٽ فيوزن ۾ IZUMO 2، 3، ۽ 4 پروٽين جا ڪم طئي نه ڪيا ويا آهن.IZUMO3 کي سپرم ڊولپمينٽ 51 دوران acrosome biogenesis ۾ ڪردار ادا ڪرڻ لاءِ سڃاتو وڃي ٿو ۽ IZUMO پروٽين هڪ ڪمپليڪس 50 ٺاهڻ لاءِ مليو آهي.IZUMO پروٽينن جو تحفظ ٿلهي جانورن، ريپٽائلس ۽ امفيبينز ۾ ڏيکاري ٿو ته انهن جو امڪاني ڪم ٻين ڄاتل گيمٽ فيوزن سان لاڳاپيل پروٽين، جهڙوڪ DCST1/2، SOF1، ۽ FIMP سان مطابقت رکي ٿو.
IST سپر فيملي جي ڊومين آرڪيٽيڪچر جو خاڪو، 4HB، hinge، ۽ Ig-جهڙوڪ ڊومينز سان ترتيب ڏنل نارنگي، سائي ۽ نيري ۾ نمايان ٿيل آهن.IZUMO4 وٽ ھڪڙو منفرد سي-ٽرمينل علائقو آھي جيڪو ڪارو ڏسڻ ۾ اچي ٿو.تصديق ٿيل ۽ پوٽيٽيو ڊسلفائيڊ بانڊز، ترتيب سان مضبوط ۽ ڊاٽ ٿيل لائينن سان ڏيکاريا ويا آهن.b IZUMO1 (PDB: 5F4E)، SPACA6، IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1)، IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1)، IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYLEM1-F1)، ۽ AlphaFold DB DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) ساڳئي رنگ جي حد ۾ ڏيکاريا ويا آهن پينل A. ڊسلفائيڊ بانڊ مئجنٽا ۾ ڏيکاريل آهن.TMEM95، IZUMO2 ۽ IZUMO3 transmembrane helices ڏيکاريل نه آهن.
IZUMO پروٽين جي برعڪس، ٻيا SPACA پروٽين (يعني، SPACA1، SPACA3، SPACA4، SPACA5، ۽ SPACA9) سوچيو وڃي ٿو ساخت جي لحاظ کان SPACA6 (Fig. S12).صرف SPACA9 وٽ 4HB آهي، پر اهو توقع ناهي ته ساڳيو متوازي-مخالف متوازي واقفيت يا ساڳيو ڊسلفائيڊ بانڊ SPACA6 وانگر.صرف SPACA1 وٽ ساڳيو Ig جهڙو ڊومين آهي.AlphaFold اڳڪٿي ڪري ٿو ته SPACA3، SPACA4 ۽ SPACA5 وٽ SPACA6 کان مڪمل طور تي مختلف جوڙجڪ آهي.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، SPACA4 کي ڀاڻ ۾ ڪردار ادا ڪرڻ لاءِ پڻ سڃاتو وڃي ٿو، پر SPACA6 کان وڏي حد تائين، سپرم ۽ oocyte zona pellucida52 جي وچ ۾ رابطي کي آسان ڪرڻ بدران.
اسان جي AlphaFold ڳولها IZUMO1 ۽ SPACA6 4HB، TMEM95 لاءِ هڪ ٻيو ميچ مليو.TMEM95، هڪ واحد سپرم-مخصوص ٽرانسميبرن پروٽين، 32,33 کي ختم ڪرڻ تي نر چوٿين کي بانجھ بڻائي ٿو.TMEM95 جي گھٽتائي واري اسپرميٽوزوا وٽ نارمل مورفولوجي، حرڪت، ۽ زونا پيلوسيڊا ۾ داخل ٿيڻ جي صلاحيت ۽ انڊيءَ جي جھلي سان جڙيل ھو، پر oocyte جھلي سان فيوز نه ٿي سگھي.اڳوڻي اڀياس ڏيکاريا آهن ته TMEM95 IZUMO133 سان ساخت جي هڪجهڙائي حصيداري ڪري ٿو.درحقيقت، الفا فولڊ ماڊل تصديق ڪئي آهي ته TMEM95 هڪ 4HB آهي ساڳئي جوڙو CXXC نقشن سان IZUMO1 ۽ SPACA6 ۽ ساڳئي اضافي ڊسلفائيڊ بانڊ جي وچ ۾ هيليڪس 1 ۽ 2 جي وچ ۾ SPACA6 (Fig. 3a ۽ S11).جيتوڻيڪ TMEM95 وٽ Ig جھڙو ڊومين نه آھي، ان ۾ ھڪڙو علائقو آھي جنھن ۾ ڊسلفائيڊ بانڊ جي نموني SPACA6 ۽ IZUMO1 ھنج وارن علائقن وانگر آھي (تصوير 3b).هن نسخي جي اشاعت جي وقت، پرنٽ سرور TMEM95 جي ساخت جي رپورٽ ڪئي، AlphaFold53 نتيجن جي تصديق ڪندي.TMEM95 SPACA6 ۽ IZUMO1 سان تمام گهڻو مشابهت رکي ٿو ۽ ارتقائي طور تي اڳ ۾ ئي امفيبين ۾ محفوظ آهي (تصوير 4 ۽ S13).
PSI-BLAST ڳولا NCBI SPACA6، IZUMO1-4، TMEM95، DCST1، DCST2، FIMP، ۽ SOF1 ڊيٽابيس استعمال ڪيو زندگي جي وڻ ۾ انهن ترتيبن جي پوزيشن کي طئي ڪرڻ لاءِ.شاخ پوائنٽن جي وچ ۾ فاصلو ماپ ۾ نه ڏيکاريا ويا آهن.
SPACA6 ۽ IZUMO1 جي وچ ۾ شاندار مجموعي ساخت جي هڪجهڙائي اها ڄاڻ ڏئي ٿي ته اهي هڪ محفوظ ڪيل ساخت جي وڏي خاندان جا باني ميمبر آهن جن ۾ TMEM95 ۽ IZUMO 2، 3، ۽ 4 پروٽين شامل آهن.سڃاتل ميمبر: IZUMO1، SPACA6 ۽ TMEM95.ڇاڪاڻ ته صرف چند ميمبرن وٽ Ig جھڙا ڊومينز آھن، IST سپر فيملي جو خاص نشان 4HB ڊومين آھي، جنھن ۾ انھن مڙني پروٽينن لاءِ منفرد خصوصيتون آھن: 1) ڪوئلڊ 4HB ھيليڪس سان گڏ ھڪ متوازي/متوازي متبادل (تصوير 1) . 5a)، 2) بنڊل ۾ هڪ ٽڪنڊي وارو چهرو هوندو آهي جنهن ۾ بنڊل جي اندر ٻه هيليڪس ۽ ٽيون عمودي هيلڪس (تصوير جو اهم علائقو (Fig. 5c) هوندو آهي. CXXC نقش، جيڪو thioredoxin-like پروٽين ۾ مليو آهي، ڪم ڪرڻ لاءِ سڃاتو وڃي ٿو. ريڊڪس سينسر جي طور تي 54,55,56، جڏهن ته IST خاندان جي ميمبرن ۾ موٽف پروٽين ڊسلفائيڊ آئسوميراسيس سان لاڳاپيل ٿي سگهي ٿو جهڙوڪ گيمٽ فيوزن ۾ ERp57. ڪردار 57,58 سان لاڳاپيل آهن.
IST جي وڏي خاندان جي ميمبرن کي 4HB ڊومين جي ٽن خاصيتن جي خاصيتن جي ذريعي بيان ڪيو ويو آهي: چار هيليڪس متوازي ۽ متوازي ۽ متوازي تعارف جي وچ ۾ متبادل، بي-ٽڪنڊي هيليڪل بنڊل منهن، ۽ هڪ ca CXXC ڊبل نقشو ٺهيل ننڍن ماليڪيولن جي وچ ۾.) اين ٽرمينل هيلڪس (نارنگي) ۽ هنج واري علائقي β-هيئر پن (سائي).
SPACA6 ۽ IZUMO1 جي وچ ۾ هڪجهڙائي ڏني وئي، اڳوڻي جي صلاحيت IZUMO1 يا JUNO سان پابند ڪرڻ جي آزمائش ڪئي وئي.Biolayer interferometry (BLI) هڪ kinetic-based پابند طريقو آهي جيڪو اڳ ۾ استعمال ڪيو ويو آهي IZUMO1 ۽ JUNO جي وچ ۾ رابطي جي مقدار کي طئي ڪرڻ لاء.IZUMO1 سان بايوٽين-ليبل ٿيل سينسر جي انڪيوبيشن کان پوءِ هڪ بيت جي طور تي JUNO تجزيي جي هڪ اعلي ڪنسنٽريشن سان، هڪ مضبوط سگنل معلوم ڪيو ويو (تصوير S14a)، اشارو ڪيو ويو ته هڪ پابند-حوصلي واري تبديلي سينسر جي ٽپ سان جڙيل بايوميٽري جي ٿلهي ۾.ساڳيون نشانيون (يعني JUNO IZUMO1 analyte جي خلاف هڪ بيت جي طور تي سينسر سان جوڙيل) (تصوير S14b).ڪو به سگنل نه مليو جڏهن SPACA6 استعمال ڪيو ويو تجزياتي طور تي سينسر پابند IZUMO1 يا سينسر پابند JUNO (Figure S14a,b).هن سگنل جي غير موجودگي ظاهر ڪري ٿي ته SPACA6 جو extracellular ڊومين IZUMO1 يا JUNO جي extracellular ڊومين سان رابطو نٿو ڪري.
ڇاڪاڻ ته BLI جو جائزو بيٽ پروٽين تي مفت ليسين جي باقيات جي بايوٽينيليشن تي مبني آهي، هي ترميم بائنڊنگ کي روڪي سگهي ٿي جيڪڏهن ليسين جي باقيات رابطي ۾ ملوث آهن.ان کان علاوه، سينسر سان تعلق رکندڙ بائنڊنگ جو رخ اسٽريڪ رڪاوٽون پيدا ڪري سگھي ٿو، تنهنڪري روايتي پل-ڊائون اسيسس پڻ ريزومبيننٽ SPACA6، IZUMO1 ۽ JUNO ectodomains تي ڪيا ويا.ان جي باوجود، SPACA6 سندس-ٽيگ ٿيل IZUMO1 يا سندس-ٽيگ ٿيل JUNO (Fig. S14c,d) سان اڳڀرائي نه ڪئي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته BLI تجربن ۾ مشاهدو ڪيل ڪنهن به رابطي سان مطابقت ناهي.مثبت ڪنٽرول جي طور تي، اسان JUNO جي رابطي جي تصديق ڪئي ليبل سان سندس IZUMO1 (شڪل S14e ۽ S15).
SPACA6 ۽ IZUMO1 جي وچ ۾ ساخت جي هڪجهڙائي جي باوجود، JUNO کي پابند ڪرڻ لاء SPACA6 جي ناڪامي تعجب جي ڳالهه ناهي.انساني IZUMO1 جي مٿاڇري تي 20 کان وڌيڪ رهجي ويا آهن جيڪي JUNO سان رابطو ڪن ٿا، جن ۾ هر هڪ ٽن علائقن مان باقي بچيل آهن (جيتوڻيڪ انهن مان گهڻا هنج واري علائقي ۾ واقع آهن) (تصوير S14f).انهن مان، صرف هڪ محفوظ آهي SPACA6 (Glu70).جڏهن ته ڪيترن ئي رهائشي متبادلن پنهنجي اصل بايو ڪيميڪل خاصيتن کي برقرار رکيو، IZUMO1 ۾ لازمي Arg160 residue SPACA6 ۾ منفي چارج ٿيل Asp148 سان تبديل ڪيو ويو؛پوئين اڀياس ڏيکاريا آهن ته IZUMO1 ۾ Arg160Glu ميوٽيشن تقريبن مڪمل طور تي JUNO43 جي پابند کي ختم ڪري ٿو.ان کان علاوه، IZUMO1 ۽ SPACA6 جي وچ ۾ ڊومين واقفيت ۾ فرق خاص طور تي SPACA6 (Fig. S14g) تي برابر علائقي جي JUNO-بائنڊنگ سائيٽ جي مٿاڇري واري علائقي کي وڌايو.
گيمٽ فيوزن لاءِ SPACA6 جي معلوم ضرورت ۽ IZUMO1 سان ان جي هڪجهڙائي جي باوجود، SPACA6 ۾ هڪ جيتري JUNO بائنڊنگ فنڪشن نظر نٿو اچي.تنهن ڪري، اسان ارتقائي حياتيات پاران مهيا ڪيل اهميت جي ثبوت سان گڏ پنهنجي ساخت جي ڊيٽا کي گڏ ڪرڻ جي ڪوشش ڪئي آهي.SPACA6 homologues جي ترتيب واري ترتيب ڏيکاري ٿي عام ڍانچي جي تحفظ کي مامرن کان ٻاهر.مثال طور، cysteine ​​residues موجود آهن جيتوڻيڪ پري سان لاڳاپيل amphibians (Fig. 6a).ConSurf سرور استعمال ڪندي، 66 ترتيبن جي گھڻن ترتيب واري ترتيب واري برقرار رکڻ واري ڊيٽا کي SPACA6 سطح تي نقشو ڪيو ويو.ھن قسم جو تجزيو ڏيکاري سگھي ٿو ته پروٽين جي ارتقاء دوران ڪھڙين رھائشن کي محفوظ ڪيو ويو آھي ۽ ظاھر ڪري سگھي ٿو ته ڪھڙا مٿاڇري علائقا ڪم ۾ ڪردار ادا ڪن ٿا.
CLUSTAL OMEGA استعمال ڪندي تيار ڪيل 12 مختلف نسلن مان SPACA6 ectodomains جي هڪ ترتيب واري ترتيب.ConSurf تجزيي موجب، سڀ کان وڌيڪ قدامت پسند پوزيشن نيري ۾ نشان لڳل آهن.سيسٽين جي باقيات ڳاڙهي ۾ نمايان ٿيل آهن.ڊومين جون حدون ۽ ثانوي ڍانچي جي عناصرن کي ترتيب جي چوٽي تي ڏيکاريو ويو آهي، جتي تير β-strands ۽ موجون هيليڪس جي نشاندهي ڪن ٿيون.NCBI رسائي جي سڃاڻپ ڪندڙ جيڪي ترتيبن تي مشتمل آھن اھي آھن: انساني (Homo sapiens, NP_001303901)، مينڊريل (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), capuchin monkey (Cebus mimic, XP_0173599, XP_0173599, XP_0173599, XP_017359, XP_01735960, caball, 201360, 2036, 2018 وهيل (Orcinus orca3_23 XP_032_034) .)، رڍ (Ovis aries، XP_014955560)، هاٿي (Loxodonta africana, XP_010585293), ڪتو (Canis lupus familyis, XP_025277208), مائوس (Mus musculus, NP_001155560)، XP_0011555638 611، XP_0318)، پلاٽائپس، 8) ، 61_89 ۽ Bullfrog (Bufo bufo، XP_040282113).انگ اکر انساني ترتيب تي ٻڌل آهي.b مٿاڇري تي 4HB سان SPACA6 ڍانچي جي مٿاڇري جي نمائندگي ۽ ھيٺئين پاسي Ig جھڙو ڊومين، ConSurf سرور کان تحفظ جي تخميني جي بنياد تي رنگ.بهترين محفوظ حصا نيري رنگ ۾ آهن، اعتدال پسند محفوظ حصا سفيد ۾ آهن، ۽ گهٽ ۾ گهٽ محفوظ ٿيل آهن پيلو رنگ ۾.جامني سيسٽين.ٽي مٿاڇري جا پيچ جيڪي اعليٰ سطح جي تحفظ جو مظاهرو ڪن ٿا تن ۾ ڏيکاريا ويا آهن انسيٽ ليبل ٿيل پيچ 1، 2 ۽ 3. هڪ 4HB ڪارٽون مٿي ساڄي پاسي انسيٽ ۾ ڏيکاريل آهي (ساڳي رنگ اسڪيم).
SPACA6 جي جوڙجڪ ۾ ٽي انتهائي محفوظ سطحي علائقا آهن (تصوير 6b).پيچ 1 4HB ۽ ھنج واري علائقي کي گھيرو ڪري ٿو ۽ ٻن محفوظ ڪيل CXXC ڊسلفائيڊ پلن تي مشتمل آھي، ھڪڙو Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 ھنج نيٽ ورڪ (Fig. S7)، ۽ ٽي محفوظ ٿيل ٻاھرين خوشبودار باقيات (Phe31, Tyr137, Phe31)Ig-like ڊومين (Fig. S6e) جو هڪ وسيع رم، جيڪو سپرم جي مٿاڇري تي ڪيترن ئي مثبت طور تي چارج ٿيل بقايا جي نمائندگي ڪري ٿو.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته هي پيچ هڪ اينٽي باڊي ايپيٽوپ تي مشتمل آهي جيڪو اڳ ۾ ڏيکاريو ويو آهي SPACA6 30 فنڪشن سان مداخلت ڪندي.علائقو 3 پکڙيل آهي ۽ هڪ پاسي Ig جهڙو ڊومين؛هن علائقي ۾ محفوظ ڪيل پرولين (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) ۽ ٻاهرئين طرف منهن ڪندڙ پولر/چارج ٿيل باقيات شامل آهن.حيرت انگيز طور تي، 4HB جي مٿاڇري تي سڀ کان وڌيڪ بقايا انتهائي متغير آهن (تصوير 6b)، جيتوڻيڪ فولڊ سڄي SPACA6 هومولوگ ۾ محفوظ آهي (جيئن ته هائيڊروفوبڪ بنڊل ڪور جي قدامت پسندي طرفان اشارو ڪيو ويو آهي) ۽ IST سپر فيملي کان ٻاهر.
جيتوڻيڪ هي SPACA6 ۾ سڀ کان ننڍڙو علائقو آهي جنهن ۾ گهٽ ۾ گهٽ سڃاڻپ ڪندڙ ثانوي ساخت جي عناصر شامل آهن، ڪيترن ئي قبضي واري علائقي جي باقيات (بشمول علائقي 3) SPACA6 homologues جي وچ ۾ انتهائي محفوظ آهن، جنهن مان ظاهر ٿئي ٿو ته هيليڪل بنڊل ۽ β-سينڊوچ جي واقفيت هڪ ڪردار ادا ڪري ٿي.هڪ قدامت پسند طور.جيتوڻيڪ، SPACA6 ۽ IZUMO1 جي هنج واري علائقي ۾ وسيع هائڊروجن بانڊنگ ۽ اليڪٽررو اسٽيٽڪ نيٽ ورڪن جي باوجود، IZUMO137,43,44 جي ڪيترن ئي اجازت ڏنل جوڙجڪ جي ترتيب ۾ اندروني لچڪداريءَ جو ثبوت ڏسي سگھجي ٿو.انفرادي ڊومينز جي ترتيب چڱي طرح اوورليپ ڪئي وئي، پر ڊومينز جو رخ هڪ ٻئي سان واسطو رکندڙ مرڪزي محور کان 50° کان 70° تائين مختلف هو (تصوير S16).حل ۾ SPACA6 جي تخليقي متحرڪ کي سمجهڻ لاء، SAXS تجربا ڪيا ويا (تصوير S17a،b).SPACA6 ectodomain جي ابتڙ بحالي هڪ راڊ ڪرسٽل ڍانچي (Fig. S18) سان مطابقت رکي ٿي، جيتوڻيڪ ڪرٽڪي پلاٽ ڪجهه حد تائين لچڪ ڏيکاريو (تصوير S17b).هي تشڪيل IZUMO1 سان متضاد آهي، جنهن ۾ اڻڄاتل پروٽين هڪ بومرينگ شڪل ٻنهي جالي ۽ محلول 43 ۾ فرض ڪري ٿو.
خاص طور تي لچڪدار علائقي کي سڃاڻڻ لاءِ، هائيڊروجن-ڊيٽريم ايڪسچينج ماس اسپيڪٽروڪوپي (H-DXMS) SPACA6 تي ڪئي وئي ۽ ان جي مقابلي ۾ اڳ ۾ IZUMO143 تي حاصل ڪيل ڊيٽا سان (Fig. 7a,b).SPACA6 واضح طور تي IZUMO1 کان وڌيڪ لچڪدار آهي، جيئن 100,000 s مٽا سٽا کان پوءِ سڄي ڍانچي ۾ اعليٰ ڊيوٽريم جي بدلي جو ثبوت آهي.ٻنهي اڏاوتن ۾، هنج علائقي جو سي-ٽرمينل حصو هڪ اعلي سطحي تبادلي کي ڏيکاري ٿو، جيڪو شايد 4HB ۽ Ig-جهڙوڪ ڊومينز جي هڪ ٻئي سان تعلق رکندڙ محدود گردش جي اجازت ڏئي ٿو.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، SPACA6 hinge جو C-ٽرمينل حصو، جنهن ۾ 147CDLPLDCP154 باقيات شامل آهن، هڪ انتهائي محفوظ علائقو 3 (Fig. 6b) آهي، ممڪن طور تي اهو ظاهر ڪري ٿو ته انٽرڊومين لچڪدار SPACA6 جي هڪ ارتقائي طور تي محفوظ خصوصيت آهي.لچڪدار تجزيي جي مطابق، سي ڊي تھرمل ميلٽ ڊيٽا ڏيکاري ٿي ته SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) کان گھٽ مستحڪم آھي (تصوير S1e ۽ S19).
SPACA6 ۽ ب IZUMO1 جون H-DXMS تصويرون.فيصد deuterium مٽا سٽا ڪئي وئي هئي اشارو وقت جي پوائنٽن تي.هائڊروجن-ڊيوٽريم جي مٽاسٽا جي سطحن کي نيري (10٪) کان ڳاڙهي (90٪) تائين گريڊينٽ اسڪيل تي رنگ سان اشارو ڪيو ويو آهي.ڪارو باڪس اعلي مٽاسٽا جي علائقن جي نمائندگي ڪن ٿا.ڪرسٽل ڍانچي ۾ 4HB، hinge ۽ Ig جھڙي ڊومين جون حدون بنيادي تسلسل کان مٿي ڏيکاريل آھن.10 s، 1000 s، ۽ 100,000 s تي Deuterium جي مٽاسٽا جي سطحن کي SPACA6 ۽ IZUMO1 جي شفاف ماليڪيولر سطحن تي مٿي ڪيل اسٽريپ چارٽ تي پلاٽ ڪيو ويو.50٪ کان هيٺ ڊيوٽريم ايڪسچينج جي سطح سان اڏاوتن جا حصا رنگا اڇا آهن.50٪ H-DXMS مٽا سٽا کان مٿي وارا علائقا گريجوئيٽ اسڪيل ۾ رنگا آهن.
CRISPR/Cas9 ۽ مائوس جين ناڪ آئوٽ جينياتي حڪمت عملين جو استعمال اسپرم ۽ ايگ بائنڊنگ ۽ فيوزن لاءِ اهم ڪيترن ئي عنصرن جي سڃاڻپ ڪري چڪو آهي.IZUMO1-JUNO ۽ CD9 ڍانچي جي چڱيءَ طرح خصوصيت واري رابطي کان سواءِ، گيمٽ فيوزن سان لاڳاپيل اڪثر پروٽين ساختي ۽ فعلي طور تي پراسرار رهن ٿا.SPACA6 جي بايو فزيڪل ۽ ڍانچي جي خصوصيت ڀاڻ جي دوران Adhesion/fusion molecular puzzle جو هڪ ٻيو ٽڪرو آهي.
SPACA6 ۽ IST جا ٻيا ميمبر انتهائي خانداني طور تي ٿلهي جي جانورن سان گڏ انفرادي پکين، ريپٽائلز ۽ امفيبينز ۾ انتهائي محفوظ نظر اچن ٿا؛حقيقت ۾، اهو سوچيو ويو آهي ته SPACA6 پڻ زيبرا فش 59 ۾ ڀاڻ لاءِ گهربل آهي. هي ورڇ ٻين ڄاتل گيمٽ فيوزن سان لاڳاپيل پروٽينن جهڙوڪ DCST134، DCST234، FIMP31، ۽ SOF132 سان ملندڙ جلندڙ آهي، اهو مشورو ڏئي ٿو ته اهي عنصر HAP2 جي گهٽتائي (پڻ. GCS1 جي نالي سان سڃاتو وڃي ٿو) پروٽين جيڪي ڪيترن ئي پروٽسٽس جي ڪيٽيليٽڪ سرگرمي لاء ذميوار آهن.، ٻوٽا، ۽ ارٿروپڊس.فرٽيلائزڊ فيوزن پروٽين 60, 61. SPACA6 ۽ IZUMO1 جي وچ ۾ مضبوط ساخت جي هڪجهڙائي جي باوجود، انهن مان ڪنهن به هڪ پروٽين کي انڪوڊنگ ڪرڻ واري جين جي ناڪ آئوٽ جي نتيجي ۾ نر چوٿين ۾ بانجھ پن پيدا ٿيو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته گيمٽ فيوزن ۾ انهن جا ڪم نقل نه ڪيا ويا آهن..وڌيڪ وسيع طور تي، فيوزن جي آسن واري مرحلي لاء گهربل سڃاتل سپرم پروٽين مان ڪوبه بيڪار ناهي.
اهو هڪ کليل سوال رهي ٿو ته ڇا SPACA6 (۽ IST سپرفاميلي جا ٻيا ميمبر) انٽرگاميٽڪ جنڪشنز ۾ حصو وٺندا آهن، اهم پروٽين کي فيوزن پوائنٽس تي ڀرتي ڪرڻ لاءِ انٽراگميٽڪ نيٽ ورڪ ٺاهيندا آهن، يا شايد اهو به ڪم ڪن ٿا ته جيئن اهي ڀوڳيندڙ فوسوجن.HEK293T سيلز ۾ Co-immunoprecipitation Studies ظاهر ڪيو مڪمل لمبائي IZUMO1 ۽ SPACA632 جي وچ ۾ هڪ رابطي.بهرحال، اسان جي ٻيهر ٺهڪندڙ ايڪٽوڊومينز ويٽرو ۾ لهه وچڙ ۾ نه هئا، اهو مشورو ڏئي ٿو ته نودا ايٽ ال ۾ ڏٺو ويو آهي.ٻنهي کي تعمير ۾ ختم ڪيو ويو (IZUMO1 جي cytoplasmic دم کي نوٽ ڪريو، جنهن کي ڀاڻ لاءِ غير ضروري ڏيکاريو ويو آهي62).متبادل طور تي، IZUMO1 ۽/يا SPACA6 کي شايد مخصوص پابند ماحول جي ضرورت هجي جيڪا اسان ويٽرو ۾ ٻيهر پيدا نه ڪندا آهيون، جهڙوڪ جسماني طور تي مخصوص ڪنفارميشنز يا ماليڪيولر ڪمپليڪس جن ۾ ٻيا پروٽين شامل آهن (سڃاتل يا اڃا دريافت نه ٿيل).جيتوڻيڪ IZUMO1 ectodomain کي مڃيو وڃي ٿو ته ثالثي اسپرماتوزوا جي آنڊي کي پريوٽيلائن اسپيس ۾ منسلڪ ڪري ٿو، SPACA6 ectodomain جو مقصد واضح ناهي.
SPACA6 جي جوڙجڪ ڪيترن ئي محفوظ سطحن کي ظاهر ڪري ٿو جيڪي پروٽين-پروٽين جي رابطي ۾ شامل ٿي سگھن ٿيون.هنج واري علائقي جو محفوظ حصو فوري طور تي CXXC موٽف جي ڀرسان آهي (مٿي ڏنل پيچ 1) ڪيترن ئي ٻاهرئين طرف منهن ڪندڙ خوشبودار رهجي ويا آهن جيڪي اڪثر ڪري بايوموليڪولس جي وچ ۾ هائيڊروفوبڪ ۽ π-اسٽيڪنگ رابطي سان لاڳاپيل هوندا آهن.Ig جهڙو ڊومين (علائقو 2) جا وسيع پاسا انتهائي محفوظ ڪيل Arg ۽ ان جي رهجي ويلن سان هڪ مثبت طور تي چارج ٿيل گروو ٺاهيندا آهن، ۽ هن علائقي جي خلاف اينٽي باڊيز اڳ ۾ گيمٽ فيوزن 30 کي بلاڪ ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيون ويون آهن.اينٽي باڊي لينئر ايپيٽوپ 212RIRPQLTHRGTFS225 کي سڃاڻي ٿي، جنهن ۾ ڇهن مان ٽي ارجنائن باقي آهن ۽ انتهائي محفوظ ڪيل هز220.اهو واضح ناهي ته ڇا خرابي انهن مخصوص رهائشي يا سڄي علائقي جي بلاڪ جي سبب آهي.β-sandwich جي C-terminus جي ويجھو ھن خال جو مقام، cis-interactions کي پاڙيسري اسپرم پروٽين سان، پر oocyte پروٽين سان نه.ان کان علاوه، هڪ انتهائي لچڪدار پرولين-امير ٽنگيل (سائيٽ 3) جي قبضي جي اندر اندر هڪ پروٽين-پروٽين جي رابطي جي سائيٽ ٿي سگهي ٿي، يا گهڻو ڪري، ٻن ڊومينز جي وچ ۾ لچڪ جي برقرار رکڻ جي نشاندهي ڪن ٿا.SPACA6 جي نامعلوم ڪردار لاء صنف اهم آهي.gametes جو ميلاپ.
SPACA6 ۾ انٽرسيلولر ايڊيشن پروٽينن جون خاصيتون آهن، جن ۾ Ig-like β-sandwiches شامل آهن.ڪيتريون ئي چپکندڙ پروٽين (مثال طور، ڪيڊرنس، انٽيگرين، ايڊيسن، ۽ IZUMO1) وٽ هڪ يا وڌيڪ β-sandwich ڊومينز آهن جيڪي پروٽين کي سيل جھلي کان انهن جي ماحولياتي مقصدن تائين وڌائين ٿا 63,64,65.SPACA6 جي Ig جھڙي ڊومين ۾ پڻ ھڪڙو نقشو عام طور تي ملندو آھي β-sandwiches of adhesion and cohesion: β-sandwiches جي پڇاڙيءَ تي متوازي تارن جا ڊبلٽس، جن کي ميڪيڪل ڪلمپس 66 طور سڃاتو وڃي ٿو.اهو يقين آهي ته هي نقشو ڪنگڻ واري قوتن جي مزاحمت کي وڌائي ٿو، جيڪو پروٽينن جي وچ ۾ رابطي ۾ شامل ٿيڻ لاء قيمتي آهي.تنهن هوندي به، adhesins سان هن هڪجهڙائي جي باوجود، في الحال ڪوبه ثبوت نه آهي ته SPACA6 هڏن جي سفيد سان رابطو ڪري ٿو.SPACA6 ectodomain JUNO کي پابند ڪرڻ جي قابل ناهي، ۽ SPACA6-expressing HEK293T سيلز، جيئن هتي ڏيکاريل آهي، مشڪل سان oocytes سان رابطو ڪري ٿو جيڪو زونا 32 جي گهٽتائي آهي.جيڪڏهن SPACA6 انٽرگاميٽڪ بانڊ قائم ڪري ٿو، انهن ڳالهين کي پوسٽ-ترجمي واري ترميمن جي ضرورت هجي يا ٻين اسپرم پروٽين جي ذريعي مستحڪم ڪيو وڃي.پوئين مفروضي جي حمايت ۾، IZUMO1-deficient spermatozoa oocytes سان جڙيل آهي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته IZUMO1 کان سواءِ ٻيا ماليڪيول گيمٽ ايڊيشن اسٽيج 27 ۾ شامل آهن.
ڪيتريون ئي وائرل، سيلولر، ۽ ڊولپمينٽ فيوزن پروٽين ۾ خاصيتون آهن جيڪي انهن جي ڪم کي فيوزن جي طور تي پيش ڪن ٿا.مثال طور، وائرل فيوزن گلائڪوپروٽين (ڪلاس I، II ۽ III) وٽ پروٽين جي آخر ۾ هڪ هائيڊروفوبڪ فيوزن پيپٽائيڊ يا لوپ هوندو آهي جيڪو ميزبان جھلي ۾ داخل ڪيو ويندو آهي.IZUMO143 جو hydrophilicity نقشو ۽ IST جي جوڙجڪ (مقرر ڪيل ۽ اڳڪٿي ڪئي وئي) وڏي خانداني طور تي ظاهري طور تي ظاهر نه ڪيو ويو هائيڊروفوبڪ فيوزن پيپٽائڊ.اهڙيءَ طرح، جيڪڏهن IST ۾ ڪو به پروٽين سپر فيملي طور ڪم ڪري ٿو fusogens، اهي ائين ڪن ٿا ٻين سڃاتل مثالن کان مختلف انداز ۾.
نتيجي ۾، گيمٽ فيوزن سان لاڳاپيل پروٽين جي IST سپر فيملي جي ميمبرن جا ڪم هڪ عجيب راز رهي ٿو.اسان جي خصوصيت SPACA6 ٻيهر ٺهندڙ ماليڪيول ۽ ان جو حل ٿيل ڍانچو انهن گڏيل ڍانچي جي وچ ۾ لاڳاپن ۽ گيميٽ منسلڪ ۽ فيوزن ۾ انهن جي ڪردار جي باري ۾ بصيرت فراهم ڪندو.
پيش ڪيل انساني SPACA6 ectodomain سان لاڳاپيل ڊي اين اي ترتيب (NCBI رسائي نمبر NP_001303901.1؛ باقيات 27-246) ڊروسوفلا ميلانوگاسٽر S2 سيلز ۾ اظهار لاءِ ڪوڊون-آپٽمائز ڪيو ويو ۽ جين ڪوفينڪس اينيمڪس سان گڏ جين سان ٺهڪيو ويو., BiP secretion سگنل ۽ لاڳاپيل 5′ ۽ 3′ هن جين جي ligation-آزاد ڪلوننگ لاءِ هڪ pMT ايڪسپريشن ويڪٽر ۾ ختم ٿي ويا آهن ميٽلوٿيونين پروموٽر جي بنياد تي پروموميسين (pMT-puro) سان چونڊ لاءِ تبديل ٿيل.pMT-puro ویکٹر هڪ thrombin cleavage سائيٽ کي انڪوڊ ڪري ٿو جنهن جي پٺيان هڪ 10x-His C-terminal tag (Figure S2).
D. melanogaster S2 (Gibco) سيلز ۾ SPACA6 pMT-puro ویکٹر جي مستحڪم منتقلي IZUMO1 ۽ JUNO43 لاءِ استعمال ڪيل پروٽوڪول وانگر ڪئي وئي.S2 سيلز شنيڊر جي وچولي (Gibco) ۾ 10٪ (v/v) گرمي جي غير فعال ٿيل جنين جي گابي سيرم (Gibco) ۽ 1X اينٽيميڪوٽڪ اينٽي بايوٽڪ (گبڪو) جي آخري ڪنسنٽريشن سان گڏ ڪيا ويا ۽ وڌايا ويا.ابتدائي گذرڻ وارا سيل (3.0 x 106 سيلز) 6-ويل پليٽس (ڪورننگ) جي انفرادي کوهن ۾ پليٽ ڪيا ويا.24 ڪلاڪن جي انڪيوبيشن کان پوءِ 27°C تي، سيلز کي 2 mg SPACA6 pMT-puro vector ۽ Effectene transfection reagent (Qiagen) جي ميلاپ سان تبديل ڪيو ويو ٺاهيندڙ جي پروٽوڪول مطابق.منتقل ٿيل سيلز کي 72 ڪلاڪن تائين سينگايو ويو ۽ پوءِ 6 mg/ml puromycin سان گڏ ڪيو ويو.سيلز کي پوءِ مڪمل شنائيڊر جي ميڊيم کان ڌار ڪيو ويو ۽ وڏي پيماني تي پروٽين جي پيداوار لاءِ سيرم فري انسيڪٽ-ايڪسپريس ميڊيم (لونزا) ۾ رکيا ويا.S2 سيل ڪلچر جي 1 L بيچ کي 8-10 × 106 ml-1 سيلن تائين وڌايو ويو 2 L وينٽيليٽ فليٽ-بوٽم پولي پروپيلين Erlenmeyer فلاسڪ ۾ ۽ پوءِ 500 µM CuSO4 (ملي پور سگما) جي آخري ڪنسنٽريشن سان جراثيم ڪش ڪيو ويو ۽ جراثيم کان پاڪ ڪيو ويو.متاثر ٿيل.4 ڏينهن تائين 120 rpm تي 27 ° C. تي پکڙيل ثقافتن کي سينگايو ويو.
SPACA6 تي مشتمل ڪنڊيشنڊ ميڊيم 5660×g تي 4°C تي سينٽرفيوگريشن ذريعي الڳ ڪيو ويو ۽ ان کان پوءِ 10 kDa MWCO جھلي سان سينٽراميٽ ٽينجنٽيل فلو فلٽريشن سسٽم (Pall Corp) سان.2 ml Ni-NTA agarose resin (Qiagen) ڪالمن ۾ SPACA6 تي مشتمل مرڪوز ميڊيم لاڳو ڪريو.Ni-NTA رال کي 10 ڪالمن جي مقدار (CV) بفر A سان ڌوئي ويو ۽ پوءِ بفر A جو 1 CV شامل ڪيو ويو ته جيئن 50 ايم ايم جي حتمي اميڊازول ڪنسنٽريشن ڏني وڃي.SPACA6 کي 10 ml بفر A سان گڏ ڪيو ويو جيڪو imidazole سان 500 mM جي آخري ڪنسنٽريشن تائين.پابندي واري ڪلاس ٿروبين (ملي پور سگما) کي سڌو سنئون شامل ڪيو ويو dialysis ٽيوبنگ (MWCO 12-14 kDa) تي 1 يونٽ في mg SPACA6 بمقابله 1 L 10 mM Tris-HCl، pH 7.5 ۽ 150 mM NaCl (buffer B).) 4 ° C تي 48 ڪلاڪن لاء.thrombin-cleaved SPACA6 کي پوءِ لوڻ جي مقدار کي گھٽائڻ لاءِ ٽي ڀيرا گھٽايو ويو ۽ 1 ml MonoS 5/50 GL ڪيٽيشن ايڪسچينج ڪالمن (Cytiva/GE) تي لوڊ ڪيو ويو جيڪو 10 mM Tris-HCl، pH 7.5 سان برابر ڪيو ويو.ڪيشن ايڪسچينج کي 3 CV سان 10 mM Tris-HCl، pH 7.5 سان ڌوئي ويو، پوءِ SPACA6 کي 10 mM Tris-HCl، pH 7.5 لاءِ 25 CV ۾ 0 کان 500 mM NaCl جي لڪير گريڊينٽ سان لڳايو ويو.آئن ايڪسچينج ڪروميٽوگرافيءَ کان پوءِ، SPACA6 کي 1 ml تي مرڪوز ڪيو ويو ۽ ENrich SEC650 10 x 300 ڪالمن (BioRad) مان isocratically eluted بفر B سان برابر ڪيو ويو. ڪروميٽوگرام جي مطابق، پول ۽ ڪنسنٽريٽ فريڪشنن تي مشتمل SPACA6.پاڪائي هڪ 16٪ SDS-polyacrylamide جيل تي Coomassie-stained electrophoresis پاران ڪنٽرول ڪيو ويو.بيئر-ليمبرٽ قانون ۽ نظرياتي molar extinction coefficient استعمال ڪندي 280 nm تي جذب ذريعي پروٽين جي مقدار جو اندازو لڳايو ويو.
صاف ٿيل SPACA6 کي 10 ايم ايم سوڊيم فاسفيٽ، پي ايڇ 7.4 ۽ 150 ايم ايم اين ايف جي خلاف رات جو ڊائل ڪيو ويو ۽ سي ڊي اسپيڪٽرو اسڪوپي پاران تجزيو ڪرڻ کان اڳ 0.16 mg/mL تائين گھٽايو ويو.185 کان 260 nm جي ويڪرائي ڦاڪ سان سي ڊيز جي اسپيڪٽرل اسڪيننگ کي Jasco J-1500 spectropolarimeter تي گڏ ڪيو ويو ڪوارٽز ڪيويٽس استعمال ڪندي 1 mm آپٽيڪل رستي جي ڊيگهه (Helma) سان 25 ° C تي 50 nm/min جي شرح سان.سي ڊي اسپيڪٽرا کي بنيادي طور تي درست ڪيو ويو، اوسط 10 حاصلات کان مٿي، ۽ مطلب ۾ تبديل ڪيو ويو بقايا بيضوي (θMRE) درجا cm2/dmol ۾:
جتي ميگاواٽ Da ۾ هر نموني جو ماليڪيولر وزن آهي؛N امينو اسيد جو تعداد آهي؛θ مليڊيگرس ۾ بيضوي آهي؛d سي ايم ۾ آپٽيڪل رستي جي ڊيگهه سان ملندڙ آهي؛يونٽن ۾ پروٽين ڪنسنٽريشن.