304 اسٽينلیس سٹیل ويلڊ ٿيل ڪوئلڊ ٽيوب/ٽيوبنگ جيميڪل زومپوننٽ، بايوسينٿيٽڪ پوٽينشل آف دي گلوبل مرين مائڪروبيوم

Nature.com گهمڻ لاءِ توهان جي مهرباني.توھان استعمال ڪري رھيا آھيو برائوزر ورزن محدود CSS سپورٽ سان.بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي بند ڪريو).اضافي طور تي، جاري مدد کي يقيني بڻائڻ لاء، اسان سائيٽ کي بغير اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ ڏيکاريون ٿا.
سلائڊر ڏيکاريندڙ ٽي مضمون في سلائڊ.سلائڊ ذريعي منتقل ڪرڻ لاء پوئتي ۽ ايندڙ بٽڻ استعمال ڪريو، يا هر سلائڊ ذريعي منتقل ڪرڻ لاء آخر ۾ سلائڊ ڪنٽرولر بٽڻ استعمال ڪريو.

تفصيلي پيداوار جي وضاحت

304 اسٽينلیس سٹیل ويلڊ ٿيل ڪوئلڊ ٽيوب/ٽيوبنگ
1. Specification: Stainless اسٽيل coil ٽيوب / ٽيوبنگ
2. قسم: welded يا seamless
3. معياري: ASTM A269، ASTM A249
4. اسٽينلیس اسٽيل ڪوئل ٽيوب OD: 6mm کان 25.4MM
5. ڊگھائي: 600-3500MM يا ڪسٽمر جي گهرج مطابق.
6. ڀت جي ٿولهه: 0.2mm کان 2.0mm.

7. رواداري: OD: +/-0.01mm؛ٿولهه: +/-0.01%.

8. ڪوئل اندروني سوراخ سائيز: 500MM-1500MM (گراهڪ جي گهرج مطابق ترتيب ڏئي سگهجي ٿو)

9. ڪوئلي جي اوچائي: 200MM-400MM (گراهڪ جي گهرج مطابق ترتيب ڏئي سگهجي ٿو)

10. مٿاڇري: روشن يا annealed
11. مواد: 304، 304L، 316L، 321، 301، 201، 202، 409، 430، 410، مصر 625، 825، 2205، 2507، وغيره.
12. پيڪنگ: ڪاٺ جي صورت ۾ اڻيل بيگ، ڪاٺ جي تختي، ڪاٺ جي شافٽ، يا ڪسٽمر جي ضرورت مطابق
13. ٽيسٽ: ڪيميائي جزو، پيداوار جي طاقت، تناسلي طاقت، سختي جي ماپ
14. گارنٽي: ٽئين پارٽي (مثال طور: SGS ٽي وي) معائنو، وغيره.
15. ايپليڪيشن: سجاڳي، فرنيچر، تيل جي نقل و حمل، گرمي ايڪسچينج، ريلنگ ٺاهڻ، ڪاغذ ٺاهڻ، گاڏين، کاڌي جي پروسيسنگ، طبي، وغيره.

قدرتي خوردبيني برادريون phylogenetically ۽ metabolically متنوع آهن.جاندارن جي اڻ پڙهيل گروپن کان علاوه، هي تنوع پڻ ماحولياتي ۽ بايو ٽيڪنالاجي جي لحاظ کان اهم اينزائمز ۽ بايو ڪيميڪل مرکبات 2,3 جي دريافت لاءِ وڏي صلاحيت رکي ٿو.بهرحال، هن تنوع جو مطالعو ڪرڻ جينوميڪ رستن کي طئي ڪرڻ لاءِ جيڪي اهڙن مرکبن کي گڏ ڪن ٿا ۽ انهن کي انهن جي لاڳاپيل ميزبانن سان جڙيل آهن هڪ چئلينج رهي ٿو.کليل سمنڊ ۾ مائڪروجنزمن جي حياتياتي صلاحيت گهڻو ڪري اڻڄاتل رهي ٿي ڇاڪاڻ ته عالمي سطح تي پوري جينوم ريزوليوشن ڊيٽا جي تجزيي ۾ حدن جي ڪري.هتي، اسان سمنڊ ۾ 10,000 مائڪروبيل جينومز کي ڪلچر ٿيل سيلز ۽ سنگل سيلز مان 25,000 کان وڌيڪ نئين تعمير ٿيل مسودو جينوم سان گڏ 1,000 کان وڌيڪ سامونڊي پاڻي جي نمونن مان ضم ڪري بائيو سنٿيٽڪ جين ڪلسٽرز جي تنوع ۽ تنوع کي ڳوليندا آهيون.انهن ڪوششن ۾ لڳ ڀڳ 40,000 جين جي سڃاڻپ ڪئي وئي آهي، اڪثر ڪري نوان بايوسئنٿيٽڪ جين ڪلسٽر، جن مان ڪجهه اڳ ۾ اڻڄاتل فائيلوجنيٽڪ گروپن ۾ مليا آهن.انهن آباديءَ ۾، اسان هڪ نسب جي سڃاڻپ ڪئي جيڪا بايوسئنٿٽڪ جين ڪلسٽرز (“Candidatus Eudormicrobiaceae”) ۾ مليل هئي جيڪا هڪ غير پوکيل بيڪٽيريا فيلم سان تعلق رکي ٿي ۽ هن ماحول ۾ ڪجهه سڀ کان وڌيڪ بايوسئنٿيڪل متنوع مائڪروجنزم شامل آهن.انهن مان، اسان phosphatase-peptide ۽ pytonamide رستن جي نشاندهي ڪئي آهي، غير معمولي بايو ايڪٽو مرڪب ساخت ۽ اينزيمولوجي جي مثالن جي نشاندهي ڪن ٿا.آخر ۾، هي مطالعو اهو ظاهر ڪري ٿو ته ڪيئن مائڪروبيوم تي ٻڌل حڪمت عمليون اڳ ۾ اڻ ڄاڻايل اينزيمس ۽ قدرتي کاڌي جي ڳولا کي فعال ڪري سگهن ٿيون هڪ خراب سمجهي مائڪروبيوٽا ۽ ماحول ۾.
مائڪروبس عالمي بايو جيو ڪيميڪل چڪر کي هلائيندا آهن، کاڌي جي جاين کي برقرار رکندا آهن، ۽ ٻوٽن ۽ جانورن کي صحتمند رکندا آهن5.انهن جي وڏي فائيلوجينيٽڪ، ميٽابولڪ ۽ فنڪشنل تنوع نئين ٽيڪسا 1، اينزائمز ۽ بايو ڪيميڪل مرکبات جي دريافت لاءِ وڏي صلاحيت جي نمائندگي ڪري ٿي، بشمول قدرتي پروڊڪٽس6.ماحولياتي برادرين ۾، اهي ماليڪيول مختلف قسم جي جسماني ۽ ماحولياتي ڪمن سان گڏ مائڪروجنزم مهيا ڪن ٿا، رابطي کان مقابلي تائين 2, 7.انهن جي اصلي ڪمن کان علاوه، اهي قدرتي شيون ۽ انهن جي جينياتي طور تي ڪوڊ ٿيل پيداوار جا رستا بايو ٽيڪنالاجي ۽ علاج واري ايپليڪيشنن لاءِ مثال مهيا ڪن ٿا 2,3.ثقافتي جراثيم جي مطالعي جي ذريعي اهڙن رستن ۽ ڪنيڪشن جي سڃاڻپ تمام گهڻي سهولت ڏني وئي آهي.بهرحال، قدرتي ماحول جي ٽيڪنيڪي اڀياس ڏيکاريا آهن ته مائڪروجنزمن جي وڏي اڪثريت پوکي نه وئي آهي8.هي ثقافتي تعصب ڪيترن ئي مائڪروبس 4,9 پاران انڪوڊ ٿيل فنڪشنل تنوع کي استحصال ڪرڻ جي اسان جي صلاحيت کي محدود ڪري ٿو.
انهن حدن کي ختم ڪرڻ لاءِ، گذريل ڏهاڪي ۾ ٽيڪنالاجي جي ترقيءَ تحقيق ڪندڙن کي سڌي طرح (يعني، اڳئين ڪلچر کان سواءِ) سموري برادرين (ميٽاگينومڪس) يا اڪيلو سيلن مان مائڪروبيل ڊي اين اي جي ٽڪرن کي ترتيب ڏيڻ جي اجازت ڏني آهي.انهن ٽڪرن کي گڏ ڪرڻ جي صلاحيت وڏن جينوم جي ٽڪڙن ۾ گڏ ڪرڻ ۽ ڪيترن ئي ميٽجينومي طور تي گڏ ٿيل جينومس (MAGs) يا سنگل ايمپليفائيڊ جينومس (SAGs) کي ترتيب ڏيڻ، ترتيب سان، مائڪروبيوم جي ٽيڪس سينٽرڪ مطالعي لاء هڪ اهم موقعو کولي ٿو (يعني، مائڪروبيل ڪميونٽيز ۽ مائڪروبيوم).نوان رستا کولڻ.ڏنل ماحول ۾ پنهنجو جينياتي مواد) 10,11,12.درحقيقت، تازو اڀياس ڌرتيء 1، 13 تي مائڪروبيل تنوع جي فائيولوجنياتي نمائندگي کي تمام گهڻو وڌايو آهي ۽ انفرادي مائڪروبيل برادرين ۾ تمام گهڻو فنڪشنل تنوع ظاهر ڪيو آهي جيڪو اڳ ۾ ڪلچرل مائڪروجنزم ريفرنس جينوم تسلسل (REFs) 14 پاران شامل نه ڪيو ويو آهي.هوسٽ جينوم (يعني جينوم ريزوليوشن) جي حوالي سان اڻ دريافت ٿيل فنڪشنل تنوع کي رکڻ جي صلاحيت اڃا تائين اڻ ڄاتل مائڪروبيل لائينن جي اڳڪٿي ڪرڻ لاءِ اهم آهي جيڪي ممڪن طور تي نئين قدرتي شين کي انڪوڊ ڪن ٿيون15,16 يا اهڙن مرکبن کي انهن جي اصل پيدا ڪندڙ ڏانهن واپس ڳولڻ لاءِ.مثال طور، هڪ گڏيل ميٽاجينومڪ ۽ سنگل سيل جينومڪ تجزيي جي طريقي سان Candidatus Entotheonella جي سڃاڻپ ڪئي وئي آهي، ميٽابولي طور تي مالدار اسپنج سان لاڳاپيل بيڪٽيريا جو هڪ گروپ، مختلف قسم جي دوا جي امڪانن جي پيداوار جي طور تي.جيتوڻيڪ، مختلف مائڪروبيل برادرين جي جينوميڪ ڳولا جي تازي ڪوششن جي باوجود، 16,19 کان وڌيڪ عالمي ميٽاجينومڪ ڊيٽا جو ٻه ٽيون حصو ڌرتيء جي سڀ کان وڏي سمنڊ جي ماحولياتي نظام 16,20 اڃا تائين غائب آهي.اهڙيء طرح، عام طور تي، بحري مائڪروبيوم جي بايوسائنٿاتي صلاحيت ۽ ناول اينزيميٽڪ ۽ قدرتي شين جي ذخيري جي طور تي ان جي صلاحيت گهڻو ڪري سمجھي وئي آهي.
عالمي سطح تي سامونڊي مائڪروبيومس جي بايوسئنٿٽڪ صلاحيت کي ڳولڻ لاءِ، اسان پهريون ڀيرو ڪلچر تي منحصر ۽ غير ثقافتي طريقن کي استعمال ڪندي حاصل ڪيل سامونڊي مائڪروبيل جينوم کي گڏ ڪيو آهي ته جيئن فائيلوجنيٽڪس ۽ جين فنڪشن جو هڪ وسيع ڊيٽابيس ٺاهي.هن ڊيٽابيس جي جاچ پڌرو ڪيو ويو ته مختلف قسم جي حياتياتي جين ڪلستر (BGCs)، جن مان گهڻا اڃا تائين اڻ ڄاڻايل جين ڪلستر (GCF) خاندانن سان تعلق رکن ٿا.ان کان علاوه، اسان هڪ اڻڄاتل بيڪٽيريا خاندان جي سڃاڻپ ڪئي جيڪا تاريخ تائين کليل سمنڊ ۾ BGCs جي سڀ کان وڌيڪ ڄاڻايل تنوع ڏيکاري ٿي.اسان ٻن ريبوسومل سنٿيسس ۽ پوسٽ-ترجمي ۾ تبديل ٿيل پيپٽائڊ (RiPP) رستا چونڊيو تجرباتي تصديق لاءِ انهن جي جينياتي اختلافن جي بنياد تي موجوده سڃاتل رستن مان.انهن رستن جي فنڪشنل خاصيت اينزيمولوجي جي غير متوقع مثالن کي ظاهر ڪيو آهي ۽ گڏوگڏ غير معمولي مرکبات پروٽيز کي روڪڻ واري سرگرمي سان.
شروعات ۾، اسان جو مقصد جينوم جي تجزيي لاءِ هڪ عالمي ڊيٽا وسيلو ٺاهڻ جو مقصد آهي، ان جي بيڪٽيريا ۽ آثار قديمه جي اجزاء تي ڌيان ڏيڻ.ان مقصد لاءِ، اسان 215 عالمي سطح تي ورهايل نمونن جي سائيٽن مان ميٽيگينومڪ ڊيٽا ۽ 1038 سامونڊي پاڻي جا نمونا گڏ ڪيا (ويڪرائي ڦاڪ = 141.6°) ۽ ڪيترائي اونها پرت (1 کان 5600 ميٽر جي اونهائي تائين، پيلاجڪ، ميسوپلاجڪ ۽ ابيسل زون کي ڍڪيندا آهن).پس منظر21,22,23 (Fig. 1a، وڌايل ڊيٽا، Fig. 1a ۽ ضمني جدول 1).وسيع جغرافيائي ڪوريج مهيا ڪرڻ کان علاوه، اهي چونڊيل فلٽر ٿيل نمونا اسان کي سامونڊي مائڪروبيوم جي مختلف حصن جو مقابلو ڪرڻ جي اجازت ڏين ٿا، جن ۾ وائرس سان مالا مال (<0.2 µm)، پروڪاريوٽڪ-رچ (0.2-3 µm)، ذرات سان مالا مال (0.8 µm) ).-20 µm) ۽ وائرس ختم ٿيل (>0.2 µm) ڪالونيون.
a، ڪل 1038 عوامي طور تي موجود جينومس (ميٽاگينومڪس) سامونڊي مائڪروبيل برادرين جا 215 عالمي سطح تي ورهايل جڳهن مان گڏ ڪيا ويا (62°S کان 79°N ۽ 179°W کان 179°E.).نقشي جي ٽائلس © Esri.ذريعن: GEBCO، NOAA، CHS، OSU، UNH، CSUMB، نيشنل جيوگرافڪ، DeLorme، NAVTEQ، ۽ Esri.b، اهي ميٽاجينومس استعمال ڪيا ويا MAGs (طريقي ۽ اضافي معلومات) کي ٻيهر ترتيب ڏيڻ لاءِ، جيڪي مقدار ۽ معيار (طريقن) ۾ ڊيٽا سيٽن ۾ مختلف آهن (رنگ ۾ نشان لڳل).تعمير ٿيل MAGs عوامي طور تي دستياب (بيروني) جينوم سان گڏ ڪيا ويا، جن ۾ هٿ سان ٺهيل MAG26، SAG27 ۽ REF شامل آهن.27 OMD مرتب ڪريو.ج، صرف SAG (GORG) 20 يا MAG (GEM) 16 جي بنياد تي پوئين رپورٽن جي مقابلي ۾، OMD سامونڊي مائڪروبيل ڪميونٽيز جي جينومڪ خاصيتن کي بهتر بڻائي ٿو (ميٽيگينومڪ ريڊ ميپنگ جي شرح؛ طريقو) ٻن کان ٽي ڀيرا وڌيڪ مسلسل نمائندگي سان. ويڪرائي ڦاڪ.<0.2, n=151, 0.2-0.8, n=67, 0.2-3, n=180, 0.8-20, n=30, >0.2, n=610, <30°, n = 132, 30–60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, OMD گروپن ۾ نسلن جي ڪلستر جي سطح (95٪ مطلب نيوڪليوٽائڊ سڃاڻپ) مجموعي طور تي سڃاڻپ ڪري ٿو. لڳ ڀڳ 8300 جنس، جن مان اڌ کان وڌيڪ اڳ ۾ GTDB (نسخ 89) اي استعمال ڪندي ٽيڪسونومڪ تشريح جي مطابق نه ڏيکاريا ويا آهن، جينوم جي قسم جي لحاظ کان نسلن جي درجه بندي ڏيکاري ٿي ته MAG، SAG ۽ REFs هڪ ٻئي کي مڪمل طور تي مڪمل ڪن ٿا. سامونڊي microbiome.خاص طور تي، 55٪، 26٪ ۽ 11٪ جنسون خاص طور تي MAG، SAG ۽ REF لاء مخصوص هئا.BATS، برمودا ائٽلانٽڪ ٽائيم سيريز؛GEM، ڌرتيء جي microbiome جي جينوم؛GORG، گلوبل سامونڊي ريفرنس جينوم؛HOT، هوائي سمنڊ وقت سيريز.
هن ڊيٽا سيٽ کي استعمال ڪندي، اسان مجموعي طور تي 26,293 MAGs کي ٻيهر ٺاهيو، اڪثر ڪري بيڪٽيريا ۽ آرڪيال (تصوير 1b ۽ وسيع ڊيٽا، تصوير. 1b).اسان اهي MAGs ٺاهيا آهن اسيمبلين مان جدا جدا جدا جدا هنڌن يا وقت جي نقطن (طريقن) جي نموني جي وچ ۾ قدرتي ترتيب جي تبديلي جي خاتمي کي روڪڻ لاءِ پول ٿيل ميٽاجينومڪ نمونن جي ڀيٽ ۾.ان کان علاوه، اسان جينوميڪ ٽڪرن جي بنياد تي انهن جي وسيع رابطي جي بنياد تي وڏي تعداد ۾ نموني (58 کان 610 نمونن تائين، سروي تي منحصر؛ طريقو).اسان ڏٺو ته اهو هڪ وقت سازي آهي پر اهم قدم 24 آهي جنهن کي ڪيترن ئي وڏي پيماني تي MAG16، 19، 25 جي تعميراتي ڪمن ۾ ڇڏيو ويو آهي ۽ خاص طور تي مقدار (2.7-گنا اوسط) ۽ معيار (اوسط تي +20٪) کي بهتر بڻائي ٿو. جينوم.هتي اڀياس ڪيل سامونڊي ميٽاگينوم مان ٻيهر تعمير ڪيو ويو (وڌيڪ ڊيٽا، تصوير 2a ۽ اضافي معلومات).مجموعي طور تي، انهن ڪوششن جي نتيجي ۾ سامونڊي مائڪروبيل MAGs ۾ 4.5-گنا اضافو ٿيو (جيڪڏهن صرف اعلي معيار جي MAGs کي سمجهيو وڃي ته 6-گنا) اڄ تائين موجود سڀ کان وڌيڪ جامع MAG وسيلن جي مقابلي ۾ 16 (طريقي).هي نئون ٺهيل MAG سيٽ وري 830 هٿ سان چونڊيل MAG26s، 5969 SAG27s ۽ 1707 REFs سان گڏ ڪيو ويو.سامونڊي بيڪٽيريا ۽ آرڪيا جون 27 جنسون 34,799 جينوم جو گڏيل مجموعو ٺاهيون ويون (تصوير 1b).
اسان وري نئين ٺاهيل وسيلن جو جائزو ورتو ته ان جي صلاحيت کي بهتر بڻائڻ لاءِ بحري مائڪروبيل برادرين جي نمائندگي ڪرڻ ۽ مختلف جينوم قسمن کي ضم ڪرڻ جي اثر جو اندازو لڳايو.سراسري طور تي، اسان اهو معلوم ڪيو آهي ته اهو تقريبا 40-60٪ سامونڊي ميٽاجينومڪ ڊيٽا (Figure 1c) تي پکڙيل آهي، ٻن کان ٽي ڀيرا اڳئين MAG-صرف رپورٽن جي ڪوريج ٻنهي جي کوٽائي ۽ ويڪرائي ڦاڪ ۾ وڌيڪ سيريل 16 يا SAG20.ان کان علاوه، منظم طور تي قائم ڪيل مجموعن ۾ ٽيڪسونومي تنوع کي ماپڻ لاءِ، اسان سڀني جينوم کي جينووم ٽيڪسونومي ڊيٽابيس (GTDB) ٽول ڪٽ (طريقو) استعمال ڪندي تشريح ڪئي ۽ 95٪ جي سراسري جينوم-وائيڊ نيوڪليوٽائڊ سڃاڻپ استعمال ڪئي.28 8,304 نسلن جي ڪلستر (ذاتي) جي سڃاڻپ ڪرڻ لاء.انهن مان ٻه ٽيون جنسون (نئين ڪليڊن سميت) اڳ ۾ GTDB ۾ ظاهر نه ٿيا هئا، جن مان 2790 دريافت ڪيا ويا MAG استعمال ڪندي هن مطالعي ۾ ٻيهر ٺاهيل (تصوير 1d).ان کان علاوه، اسان ڏٺو ته مختلف قسم جا جينوم انتهائي مڪمل آهن: 55٪، 26٪، ۽ 11٪ جنس مڪمل طور تي MAG، SAG ۽ REF، ترتيب سان ٺهيل آهن (تصوير 1e).ان کان علاوه، MAG سڀني 49 قسمن کي پاڻي جي ڪالمن ۾ مليا، جڏهن ته SAG ۽ REF صرف انهن مان 18 ۽ 11 جي نمائندگي ڪن ٿا.بهرحال، SAG سڀ کان وڌيڪ عام ڪلڊس جي تنوع جي نمائندگي ڪري ٿو (وڌايو ويو ڊيٽا، تصوير. 3a)، جهڙوڪ Pelagic Bacteriales (SAR11)، SAG سان لڳ ڀڳ 1300 نسلن کي ڍڪي ٿو ۽ MAG صرف 390 جنس.خاص طور تي، REFs گهٽ ۾ گهٽ MAGs يا SAGs سان نسلن جي سطح تي اوورليپ ٿيل آهن ۽ نمائندگي ڪن ٿا تقريبن 1000 جينومن مان 95٪ جيڪي هتي پڙهيل کليل سمنڊ جي ميٽاجينومڪ سيٽن ۾ نه مليا آهن، خاص طور تي ٻين قسمن جي ڌار ڌار نمائندن سامونڊي نمونن سان رابطي جي ڪري (مثال طور سلاد) .يا ميزبان ساٿي).سائنسي برادريءَ کي وڏي پيماني تي دستياب بڻائڻ لاءِ، هي سامونڊي جينوم وسيلو، جنهن ۾ اڻ ورهايل ٽڪرا به شامل آهن (مثال طور، اڳڪٿي ڪيل مرحلن مان، جينومڪ جزائر، ۽ جينوم جا ٽڪرا جن لاءِ MAG جي بحاليءَ لاءِ ڪافي ڊيٽا نه آهي)، ٽيڪنامڪ ڊيٽا سان مقابلو ڪري سگهجي ٿو. .اوشن مائڪروبيولوجي ڊيٽابيس (OMD؛ https://microbiomics.io/ocean/).
ان کان پوءِ اسان کليل سامونڊي مائڪرو بائيومس ۾ بايوسئنٿيٽڪ صلاحيت جي دولت ۽ نواڻ کي ڳولڻ لاءِ نڪتاسين.ان جي پڇاڙيءَ ۾، اسان سڀ کان پهريان antiSMASH استعمال ڪيو مڙني MAGs، SAGs، ۽ REFs لاءِ 1038 سامونڊي ميٽاجينومس (طريقن) ۾ مليا مجموعي طور تي 39,055 BGCs جي اڳڪٿي ڪرڻ لاءِ.ان کان پوء اسان انهن کي 6907 غير فالتو GCFs ۽ 151 جين ڪلستر جي آبادي ۾ گروپ ڪيو (GCCs؛ ضمني جدول 2 ۽ طريقا) موروثي بيڪارگي جي حساب سان (يعني، ساڳئي BGC ڪيترن ئي جينوم ۾ انڪوڊ ٿي سگهي ٿو) ۽ ميٽيگينومڪ ڊيٽا فريگمينٽيشن بي سي جي مرڪزيت.نامڪمل BGCs خاص طور تي نه وڌيون، جيڪڏهن ڪو (ضمني معلومات)، GCFs ۽ GCCs جو تعداد، ترتيب سان، 44٪ ۽ 86٪ ڪيسن ۾ گهٽ ۾ گهٽ هڪ برقرار BGC ميمبر شامل آهن.
جي سي سي جي سطح تي، اسان کي پيش ڪيل رپي پيز ۽ ٻين قدرتي شين جي وسيع قسم مليا (تصوير 2a).انهن مان، مثال طور، آريلپولينز، ڪيروٽينائڊس، ايڪٽوئنز، ۽ سائڊروفورس GCCs سان تعلق رکن ٿا جن ۾ وسيع فائيولوجينيٽڪ ورهاست ۽ سامونڊي ميٽاجينومس ۾ وڏي مقدار آهي، جيڪا شايد سامونڊي ماحول ۾ مائڪروجنزم جي وسيع موافقت جي نشاندهي ڪري ٿي، بشمول رد عمل واري اسپيسجن جي مزاحمت، آڪسيجن جي مزاحمت. oxidative ۽ osmotic دٻاء..يا لوهه جذب (وڌيڪ ڄاڻ).هي فنڪشنل تنوع NCBI RefSeq ڊيٽابيس ۾ ذخيرو ٿيل تقريبن 190,000 جينومس جي وچ ۾ لڳ ڀڳ 1.2 ملين BGCs جي تازي تجزيي سان متضاد آهي (BiG-FAM/RefSeq، بعد ۾ RefSeq) جو حوالو ڏنو ويو آهي. ide synthase (PKS) BGCs (ضمني معلومات).اسان پڻ مليا 44 (29٪) GCCs صرف ڪنهن به RefSeq BGC (\(\bar{d}\)RefSeq > 0.4 سان لاڳاپيل آهن، تصوير 2a ۽ طريقا) ۽ 53 (35٪) GCCs صرف MAG ۾، امڪاني کي اجاگر ڪندي OMD ۾ اڳ ۾ اڻ ڄاڻايل ڪيميائي کي ڳولڻ لاء.ڏنو ويو آهي ته انهن مان هر هڪ GCCs امڪاني طور تي انتهائي متنوع بايوسائنٿڪ ڪمن جي نمائندگي ڪن ٿا، اسان GCF سطح تي ڊيٽا کي وڌيڪ تجزيو ڪيو ته BGCs جو وڌيڪ تفصيلي گروپ مهيا ڪرڻ جي ڪوشش ۾ هڪجهڙائي واري قدرتي شين لاءِ ڪوڊ جي اڳڪٿي ڪئي وئي 29.مجموعي طور تي 3861 (56٪) سڃاڻپ ٿيل GCFs RefSeq سان اوورليپ نه ٿيا، ۽ > 97٪ GCFs MIBiG ۾ موجود نه هئا، تجرباتي طور تي تصديق ٿيل BGCs جي وڏي ڊيٽابيس مان هڪ (شڪل 2b).جڏهن ته سيٽنگن ۾ ڪيترن ئي امڪاني ناول رستن کي دريافت ڪرڻ حيرت جي ڳالهه ناهي جيڪي ريفرنس جينوم جي چڱيءَ طرح نمائندگي نه ڪندا آهن، بينچ مارڪنگ کان اڳ بي جي سيز کي GCFs ۾ رد ڪرڻ لاءِ اسان جو طريقو پوئين رپورٽن 16 کان مختلف آهي ۽ اسان کي اجازت ڏئي ٿو ته اسان کي نوانيت جو غيرجانبدار جائزو مهيا ڪري سگهون.نون تنوع مان گھڻا (3012 GCF يا 78%) اڳڪٿي ڪيل terpenes، RiPP يا ٻين قدرتي پراڊڪٽس سان ملن ٿا، ۽ گھڻا (1815 GCF يا 47%) اڻڄاتل قسمن ۾ انڪوڊ ٿيل آھن انھن جي بايوسئنٿيٽڪ صلاحيت جي ڪري.PKS ۽ NRPS ڪلستر جي برعڪس، اهي ڪمپيڪٽ BGCs ميٽاجينومڪ اسيمبلي 31 جي دوران ٽڪرا ٽڪرا ٿيڻ جو امڪان گهٽ آهن ۽ انهن جي شين جي وڌيڪ وقت ۽ وسيلن جي گنجائش واري فنڪشنل خاصيت جي اجازت ڏين ٿا.
مجموعي طور تي 39,055 BGCs کي 6,907 GCFs ۽ 151 GCCs ۾ ورهايو ويو.a، ڊيٽا جي نمائندگي (اندروني خارجي).GCC جي بنياد تي بي جي سي جي فاصلن جي درجه بندي ڪلسترنگ، جن مان 53 صرف MAG پاران مقرر ڪيا ويا آھن.GCC مختلف ٽيڪسا (ln-transformed gate فریکوئنسي) مان BGCs ۽ مختلف BGC طبقن تي مشتمل آهي (دائرو سائيز ان جي تعدد سان مطابقت رکي ٿو).هر GCC لاءِ، ٻاهرئين پرت نمائندگي ڪري ٿي BGCs جو تعداد، پکڙجڻ (نمونن جو سيڪڙو) ۽ فاصلو (گهٽ ۾ گهٽ BGC ڪوسائن فاصلو (min(dMIBiG))) BiG-FAM کان BGC تائين.تجرباتي طور تي تصديق ٿيل BGCs (MIBiG) سان ويجهي سان لاڳاپيل BGCs سان GCCs تير سان نمايان ٿيل آهن.b اڳڪٿي ڪيل (BiG-FAM) ۽ تجرباتي طور تي تصديق ٿيل (MIBiG) BGCs سان GCF جو مقابلو ڪندي، 3861 نوان (d–>0.2) GCF مليا ويا.RiPP، terpenes، ۽ ٻين پوکيندڙ قدرتي شين لاء انهن ڪوڊ مان اڪثر (78٪).c، OMD ۾ 1038 سمندري ميٽاجينومس ۾ مليا سڀئي جينوم GTDB بيس ٽري ۾ رکيا ويا ته جيئن OMD جي فائيلوجينيٽڪ ڪوريج ڏيکاري.او ايم ڊي ۾ بغير ڪنهن جينوم جي ڪليڊس گرين رنگ ۾ ڏيکاريل آهن.BGCs جو تعداد ڏنل ڪليڊ ۾ پيش ڪيل بي جي سي في جينوم جي سڀ کان وڏي تعداد سان ملندو آھي.وضاحت لاء، آخري 15٪ نوڊس ختم ٿي ويا آهن.تير، BGC (> 15 BGC) سان مالا مال ڪليڊن جي نشاندهي ڪن ٿا، سواءِ Mycobacterium، Gordonia (صرف روڊوڪوڪس کان ٻئي نمبر تي) ۽ Crocosphaera (Synechococcus کان ٻئي نمبر تي).ڊي، نامعلوم ج.Eremiobacterota سڀ کان وڌيڪ biosynthetic تنوع ڏيکاريو (شانن انڊيڪس قدرتي پيداوار جي قسم جي بنياد تي).هر بينڊ جينوم جي نمائندگي ڪري ٿو جن ۾ سڀ کان وڌيڪ BGCs آهن.T1PKS، PKS قسم I، T2/3PKS، PKS قسم II ۽ قسم III.
دولتمندي ۽ نواڻ جي اضافي ۾، اسان سامونڊي مائڪروبيوم جي بايوسنٿٿڪ صلاحيت جي بايو جيوگرافڪ ڍانچي کي ڳوليندا آهيون.سراسري ميٽاجينومڪ GCF ڪاپي نمبر ورهائڻ (طريقن) جي نموني جي گروهه ڏيکاري ٿي ته گهٽ ويڪرائي ڦاڪ، مٿاڇري، پروڪاريوٽڪ-امير ۽ وائرس-غريب برادريون، اڪثر ڪري مٿاڇري يا گہرے سجيل پاڻي مان، RiPP ۽ BGC terpenes ۾ مالا مال هئا.ان جي ابتڙ، پولر، گہرے سمنڊ، وائرس- ۽ ذرات سان مالا مال برادرين NRPS ۽ PKS BGC (وڌايل ڊيٽا، تصوير. 4 ۽ اضافي معلومات) جي اعليٰ مقدار سان لاڳاپيل هئا.آخر ۾، اسان ڏٺو ته چڱيءَ طرح اڀياس ڪيل اڀرندڙ اڀرندڙ اڀرندڙ ۽ پيلاجڪ برادريون نون terpenes (Augmented Data Figure) جا سڀ کان وڌيڪ ذهين ذريعا آهن.PKS، RiPP ۽ ٻين قدرتي پراڊڪٽس لاءِ تمام گهڻي صلاحيت (شڪل 5a توسيع ٿيل ڊيٽا سان).
اسان جي مطالعي کي پورو ڪرڻ لاءِ بائيو سنٿٿڪ امڪاني سامونڊي مائڪروبيومس، اسان جو مقصد انهن جي فائيولوجينيٽڪ ڊسٽري بيوشن کي ماپڻ ۽ نئين BGC-اعتراف ٿيل ڪلڊس جي سڃاڻپ ڪرڻ آهي.ان جي نتيجي ۾، اسان سامونڊي مائڪروبس جي جينوم کي هڪ عام GTDB13 بيڪٽيريا ۽ آرڪيال فائيلوجنيٽڪ وڻ ۾ رکيا آهن ۽ انهن کي انڪوڊ ٿيل پوٽيٽيو بايوسئنٿيٽڪ رستا کي مٿي ڪيو (تصوير 2c).اسان آساني سان سمنڊ جي پاڻيءَ جي نمونن (طريقن) ۾ ڪيترن ئي BGC-اعتدال ٿيل ڪلڊس (15 کان وڌيڪ BGCs جي نمائندگي ڪن ٿا) ڳوليا آهن جيڪي انهن جي حياتياتي صلاحيت لاءِ سڃاتل آهن، جهڙوڪ سائانو بيڪٽيريا (Synechococcus) ۽ پروٽينس بيڪٽيريا، جهڙوڪ Tistrella32,33، يا تازو انهن جي لاءِ ڌيان ڇڪايو ويو آهي. قدرتي مصنوعات.جهڙوڪ Myxococcota (Sandaracinaceae)، Rhodococcus ۽ Planctomycetota34,35,36.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، اسان انهن ڪليڊن ۾ ڪيترائي اڳ ۾ اڻ ڄاتل نسب ڏٺا.مثال طور، اهي جنسون جن ۾ phyla Planctomycetota ۽ Myxococcota ۾ سڀ کان وڌيڪ بايوسئنٿيٽڪ صلاحيتون آهن، انهن جو تعلق ترتيب وار غير مخصوص اميدوار آرڊر ۽ نسل سان آهي (ضمني جدول 3).گڏجي گڏ ڪيو ويو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته OMD اڳئين اڻڄاتل فائيولوجنياتي معلومات تائين رسائي فراهم ڪري ٿي، جنهن ۾ مائڪروجنزم شامل آهن، جيڪي اينزيم ۽ قدرتي پيداوار جي دريافت لاء نئين هدفن جي نمائندگي ڪري سگھن ٿا.
اڳيون، اسان بي جي سي-اثر ٿيل ڪليڊ کي نه رڳو ان جي ميمبرن پاران انڪوڊ ٿيل BGCs جي وڌ ۾ وڌ تعداد کي ڳڻڻ سان، پر انهن BGCs جي تنوع جو جائزو وٺڻ سان، جيڪو مختلف قسم جي قدرتي اميدوار شين جي تعدد کي بيان ڪري ٿو (تصوير 2c ۽ طريقا. )..اسان ڏٺا ته سڀ کان وڌيڪ حياتياتي طور تي متنوع نسلن جي نمائندگي ڪئي وئي خاص طور تي انجنيئر ٿيل بيڪٽيريا MAGs هن مطالعي ۾.اهي بيڪٽيريا غير پوکيل فيلم Candidatus Eremiobacterota سان تعلق رکن ٿا، جيڪي ڪجهه جينومڪ مطالعي کان سواءِ 37,38 کان وڌيڪ اڻ دريافت ٿيل آهن.اهو قابل ذڪر آهي ته "ca.جينس Eremiobacterota صرف هڪ زميني ماحول ۾ تجزيو ڪيو ويو آهي 39 ۽ اهو معلوم ناهي ته BGC ۾ شامل ڪيل ميمبرن کي شامل ڪيو وڃي.هتي اسان هڪ ئي نسل جي اٺن MAGs کي ٻيهر ٺاهيو آهي (نيوڪليوٽائڊ سڃاڻپ > 99٪) 23. ان ڪري اسان ان نسل جو نالو تجويز ڪريون ٿا “Candidatus Eudoremicrobium malaspinii”، جنهن جو نالو نيريڊ (سمنڊ جي نميف) جي نالي سان رکيو ويو آهي، جيڪو يوناني تصوف ۽ Expeditions ۾ هڪ خوبصورت تحفو آهي.”ڪا.phylogenetic annotation 13 جي مطابق، E. malaspinii جو ڪو به اڳوڻو سڃاتل رشتو نه آهي جيڪو تسلسل جي سطح کان هيٺ آهي ۽ اهڙيءَ طرح هڪ نئين بيڪٽيريا خاندان سان تعلق رکي ٿو جنهن کي اسان "Ca.E. malaspinii” قسم جي جنس ۽ “Ca.Eudormicrobiaceae” سرڪاري نالو طور (ضمني معلومات).مختصر metagenomic بحالي جي 'Ca.E. malaspinii جينوم پروجيڪٽ جي تصديق ڪئي وئي تمام گهٽ ان پٽ، ڊگهي پڙهيل ميٽاجينومڪ تسلسل ۽ هڪ واحد نموني جي ٽارگيٽ اسمبلي (طريقن) جي طور تي هڪ واحد 9.63 Mb لڪير ڪروموزوم 75 kb نقل سان.صرف باقي ابهام جي طور تي.
هن نسل جي فائيلوجينيٽڪ حوالي سان قائم ڪرڻ لاءِ، اسان تارا سمنڊ جي سفر مان ٽارگيٽ ڪيل جينوم جي بحاليءَ ذريعي اضافي يوڪريوٽڪ-اثرائتي ميٽاجينومڪ نموني ۾ 40 ويجهن لاڳاپيل جنسن جي ڳولا ڪئي.مختصر طور تي، اسان "Ca.E. malaspinii" ۽ اهو فرض ڪيو ويو آهي ته هن نموني ۾ وڌندڙ ڀرتي جي شرح ٻين مائٽن (طريقن) جي موجودگي کي ظاهر ڪري ٿي.نتيجي طور، اسان کي 10 MAGs مليا، 19 MAGs جو هڪ مجموعو جيڪو پنج نسلن جي نمائندگي ڪري ٿو ٽن نسلن ۾ هڪ نئين بيان ڪيل خاندان (يعني “Ca. Eudormicrobiaceae”).دستي معائنو ۽ معيار جي ڪنٽرول کان پوء (وڌايو ويو ڊيٽا، تصوير 6 ۽ اضافي معلومات)، اسان ڏٺو ته "Ca.Eudormicrobiaceae نسلن ۾ ٻين “Ca” ميمبرن جي ڀيٽ ۾ وڏا جينوم (8 Mb) ۽ وڌيڪ بايوسئنٿيٽڪ صلاحيت (14 کان 22 BGC في جنس) موجود آهن.ڪليڊ Eremiobacterota (7 BGC تائين) (Fig. 3a-c).
الف، پنجن Ca.Eudormicrobiaceae جي نسلن BGC جي اميرن کي ڏيکاريو ته هن مطالعي ۾ سڃاڻپ ڪيل سامونڊي لائينن لاءِ مخصوص.phylogenetic وڻ ۾ سڀ 'Ca' شامل آهن.MAG Eremiobacterota ۽ GTDB (نسخ 89) ۾ مهيا ڪيل ٻين فيلا جا ميمبر (بریکٹ ۾ جينوم نمبر) ارتقائي پس منظر (طريقن) لاءِ استعمال ڪيا ويا.ٻاهريون پرتون خانداني سطح تي (“Ca. Eudormicrobiaceae” ۽ “Ca. Xenobiaceae”) ۽ درجي جي سطح تي (“Ca. Eremiobacteria”) طبقن جي نمائندگي ڪن ٿيون.هن مطالعي ۾ بيان ڪيل پنج جنسون الفانومري ڪوڊس ۽ تجويز ڪيل binomial نالن (ضمني معلومات) جي نمائندگي ڪن ٿا.ب، ٺيڪ.Eudormicrobiaceae نسلن ۾ ست عام BGC نيوڪلي شيئر ڪن ٿا.A2 ڪليڊ ۾ BGC جي غير موجودگي نمائندي MAG (ضمني جدول 3) جي نامڪمليت جي ڪري هئي.BGCs مخصوص آهن "Ca.Amphithomicrobium" ۽ "Ca.Amphithomicrobium" (ڪلڊس A ۽ B) نه ڏيکاريا ويا آهن.c، سڀ BGCs انڪوڊ ٿيل "Ca.Eudoremicrobium taraoceanii کي تارا جي سمنڊن مان ورتل 623 ميٽ ٽرانسڪرپٽومس ۾ ظاهر ڪيو ويو.مضبوط حلقن کي فعال ٽرانسپشن جي نشاندهي ڪن ٿا.نارنگي حلقا log2-تبديل ٿيل فولڊ تبديلين کي ھيٺ ۽ مٿي گھر جي سنڀال جي جين اظهار جي شرح (طريقن) جي نشاندهي ڪن ٿا.d، لاڳاپا گهڻائي وکر (طريقو) ڏيکاريو 'Ca.Eudormicrobiaceae جون قسمون اڪثر سامونڊي ڪنارن ۾ ۽ پوري پاڻيءَ جي ڪالمن ۾ (مٿاڇري کان گهٽ ۾ گهٽ 4000 ميٽر جي اونهائي تائين) پکڙيل آهن.انهن تخميني جي بنياد تي، اسان ڏٺو ته 'Ca.E. malaspinii deep-sea pelagic grain-ssociated communities ۾ prokaryotic cells جو 6 سيڪڙو تائين حساب ڪري ٿو.اسان ھڪڙي نسل کي ھڪڙي سائيٽ تي موجود سمجھندا آھيو جيڪڏھن اھو ھڪڙي ڏنل کوٽائي واري پرت جي ماپ جي ڪنھن حصي ۾ ملي.IO - هندي سمنڊ، NAO - اتر ائٽلانٽڪ، NPO - اتر پئسفڪ، RS - ڳاڙھو سمنڊ، SAO - ڏکڻ ائٽلانٽڪ، SO - ڏاکڻي سمنڊ، SPO - ڏکڻ پئسفڪ.
Ca جي ڪثرت ۽ تقسيم جو مطالعو.Eudormicrobiaceae، جنهن کي، جيئن اسان ڏٺو، گهڻو ڪري سامونڊي ڪنارن تي غالب آهي، ۽ گڏوگڏ سڄي پاڻي جي ڪالمن ۾ (تصوير 3d).مقامي طور تي، اهي سامونڊي مائڪروبيل ڪميونٽي جو 6٪ ٺاهيندا آهن، انهن کي عالمي سامونڊي مائڪروبيوم جو هڪ اهم حصو بڻائيندو آهي.ان کان علاوه، اسان Ca.Eudormicrobiaceae اسپيسز ۽ انهن جي BGC ايڪسپريشن ليول يوڪريوٽڪ اينريچڊ فريڪشن (Fig. 3c ۽ وڌايل ڊيٽا، Fig. 7) ۾ سڀ کان وڌيڪ هئي، جنهن ۾ ذرڙن جي مادي سان ممڪن رابطي جو اشارو آهي، بشمول پلاڪٽن.هي مشاهدو 'Ca' سان ڪجهه مشابهت رکي ٿو.Eudoremicrobium BGCs جيڪي ڄاتل رستا ذريعي سائٽوٽوڪسڪ قدرتي پراڊڪٽس پيدا ڪن ٿيون شايد شڪاري رويي جي نمائش ڪن ٿيون (ضمني معلومات ۽ توسيع ٿيل ڊيٽا، شڪل 8)، ٻين شڪارين سان ملندڙ جلندڙ جيڪي خاص طور تي ميٽابولائٽس پيدا ڪن ٿيون جهڙوڪ Myxococcus41.Ca. جي دريافت.Eudormicrobiaceae ۾ گھٽ دستياب (گہرا سمنڊ) يا يوڪريوٽڪ بجاءِ پروڪريوٽڪ نمونن جي وضاحت ڪري سگھي ٿي ته اهي بيڪٽيريا ۽ انهن جي غير متوقع BGC تنوع قدرتي کاڌي جي تحقيق جي حوالي سان واضح ڇو نه رهي.
آخرڪار، اسان تجرباتي طور تي اسان جي microbiome تي ٻڌل ڪم جي واعدي جي تصديق ڪرڻ جي ڪوشش ڪئي نئين رستا، اينزائمز ۽ قدرتي شين کي دريافت ڪرڻ ۾.BGCs جي مختلف طبقن جي وچ ۾، RiPP رستو هڪ امير ڪيميائي ۽ فعلي تنوع کي انڪوڊ ڪرڻ لاءِ سڃاتو وڃي ٿو ڇاڪاڻ ته بنيادي پيپٽائڊ جي مختلف پوسٽ-ترجمي واري تبديلين جي ڪري بالغ اينزيمس 42 ذريعي.تنهنڪري اسان ٻه 'Ca' چونڊيو.Eudoremicrobium' RiPP BGCs (Figures 3b ۽ 4a-e) ڪنهن به ڄاڻايل BGC (\(\bar{d}\)MIBiG ۽ \(\bar{d}\)RefSeq مٿي 0.2) تي ٻڌل آهن.
a-c، ان ويٽرو هيٽرولوگس ايڪسپريشن ۽ ان ويٽرو اينزيميٽڪ اسيسز آف ناول (\(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) ڪلسٽر جو RiPP biosynthesis خاص گہرے سمنڊ Ca نسلن لاءِ.E. malaspinii' diphosphorylated مصنوعات جي پيداوار جو سبب بڻيو.ج، تبديلين جي سڃاڻپ اعلي ريزوليوشن (HR) MS/MS (ڪيميائي ڍانچي ۾ b ۽ y آئنز پاران ظاهر ڪيل ٽڪرا) ۽ NMR (وڌايل ڊيٽا، تصوير. 9).d، هي فاسفوريليٽ پيپٽائڊ ممالين نيوٽروفيل ايلسٽس جي گھٽ مائڪرومولر انبيشن کي نمايان ڪري ٿو، جيڪو ڪنٽرول پيپٽائيڊ ۽ ڊيهائيڊريٽنگ پيپٽائڊ (ڪيميائي خارج ڪرڻ واري ڊيهائيڊريشن) ۾ نه ملي ٿو.تجربا ساڳئي نتيجن سان ٽي ڀيرا بار بار ڪيو ويو.مثال طور، هڪ ٻئي ناول جو هيٽرولوجس اظهار \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) پروٽين جي بايو سنٿيسس جو ڪلستر چار بالغ اينزائمز جي ڪم کي واضح ڪري ٿو جيڪي 46 امينو ايسڊ ڪور پيپٽائيڊ کي تبديل ڪن ٿا.رهجي ويل تبديلين جي سائيٽ جي مطابق HR-MS/MS، آاسوٽوپ ليبلنگ، ۽ NMR تجزيي (ضمني معلومات) جي پيشڪش جي مطابق داغ ٿيل آهن.ڊش ٿيل رنگ ظاهر ڪري ٿو ته تبديلي ٻن باقين مان ڪنهن هڪ تي ٿئي ٿي.انگ اکر ڪيترن ئي heterologous تعميرات جو هڪ مجموعو آهي ته جيئن هڪ ئي مرڪز تي سڀني بالغ انزايمز جي سرگرمي کي ڏيکاري.h، پٺي جي بون امائيڊ اين-ميٿيليشن لاءِ NMR ڊيٽا جو مثال.مڪمل نتيجا تصوير ۾ ڏيکاريل آهن.10 وڌايل ڊيٽا سان.i، MIBiG 2.0 ڊيٽابيس ۾ مليل سڀني FkbM ڊومينز جي وچ ۾ بالغ FkbM پروٽين ڪلسٽر اينزائم جي Phylogenetic پوزيشن هن خاندان جي هڪ اينزيم کي ظاهر ڪري ٿي N-methyltransferase سرگرمي (ضمني معلومات).BGCs (a، e) جي اسڪيمي ڊاگرام، اڳوڻو پيپٽائڊ ڍانچي (b، f)، ۽ قدرتي شين جي پوٽيٽو ڪيميائي جوڙجڪ (c، g) ڏيکاريا ويا آھن.
پهريون RiPP رستو (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) صرف گہرے سمنڊ جي نسلن ۾ مليو هو “Ca.E. malaspinii” ۽ ڪوڊس فار پيپٽائڊ- اڳڪٿي ڪندڙ (Fig. 4a, b).هن بالغ اينزيم ۾، اسان هڪ واحد فنڪشنل ڊومين هومولوگس جي سڃاڻپ ڪئي آهي لينٽيپيپٽائڊ سنٿس جي ڊيهائيڊريشن ڊومين ۾ جيڪو عام طور تي فاسفوريليشن ۽ بعد ۾ 43 (ضمني معلومات) کي ختم ڪرڻ کي ترتيب ڏئي ٿو.تنهن ڪري، اسان اڳڪٿي ڪريون ٿا ته اڳوڻو پيپٽائڊ جي ترميم ۾ اهڙي ٻه قدم ڊيهائيڊريشن شامل آهي.جڏهن ته، ٽينڊم ماس اسپيڪٽروميٽري (MS/MS) ۽ ايٽمي مقناطيسي گونج اسپيڪٽروڪوپي (NMR) کي استعمال ڪندي، اسان هڪ پولي فاسفوريلائيڊ لينر پيپٽائيڊ (Fig. 4c) جي سڃاڻپ ڪئي.جيتوڻيڪ غير متوقع طور تي، اسان ان جي آخري پراڊڪٽ جي حمايت ڪرڻ لاء ثبوت جا ڪيترائي سٽون مليا آهن: ٻه مختلف هيٽرولوگس هوسٽ ۽ ويٽرو اسيسز ۾ ڪو به ڊيهائيڊريشن، بالغ اينزيم جي ڪيٽيليٽيڪ ڊيهائيڊريشن سائيٽ ۾ ميوٽيٽ ٿيل اهم ريزيديشن جي سڃاڻپ.سڀ "Ca" پاران تعمير ٿيل.E. malaspinii جينوم (وڌايو ويو ڊيٽا، تصوير. 9 ۽ اضافي معلومات) ۽، آخرڪار، فاسفوريلڊ پراڊڪٽ جي حياتياتي سرگرمي، پر ڪيميائي طور تي ٺهڪندڙ ڊيهائيڊريٽ فارم (تصوير 4d).حقيقت ۾، اسان اهو معلوم ڪيو آهي ته اهو نيوٽروفيل ايلسٽيس جي خلاف هڪ گهٽ مائڪرومولر پروٽيز روڪڻ واري سرگرمي کي ظاهر ڪري ٿو، ٻين لاڳاپيل قدرتي شين جي مقابلي ۾ ڪنسنٽريشن رينج (IC50 = 14.3 μM) 44، ان حقيقت جي باوجود ته ماحولياتي ڪردار کي واضح ڪيو وڃي.انهن نتيجن جي بنياد تي، اسان تجويز ڪريون ٿا ته رستي جو نالو "phospheptin".
ٻيو ڪيس هڪ پيچيده RiPP رستو مخصوص آهي 'Ca.جينس Eudoremicrobium (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) پيشنگوئي ڪئي وئي هئي ته قدرتي پروٽين جي شين کي انڪوڊ ڪرڻ لاءِ (Fig. 4e).اهي رستا خاص طور تي بايو ٽيڪنالاجي دلچسپي جا آهن ڇاڪاڻ ته متوقع کثافت ۽ مختلف قسم جي غير معمولي ڪيميائي تبديلين جي انزايمز پاران قائم ڪيل نسبتا مختصر BGCs45 پاران انڪوڊ ٿيل آهن.اسان ڏٺا ته هي پروٽين اڳئين خصوصيت رکندڙ پروٽينن کان مختلف آهي ان ڪري ان ۾ پولي سيرامائڊس جو بنيادي NX5N نقشو ۽ لينڊورنامائيڊس 46 جي لانٿيونائن لوپ ٻنهي جي کوٽ آهي.عام heterologous اظهار جي نمونن جي حدن کي ختم ڪرڻ لاء، اسان انهن کي استعمال ڪيو هڪ ڪسٽم Microvirgula aerodenitrificans سسٽم سان گڏ چار بالغ رستي واري اينزيمس (طريقن) کي خاص ڪرڻ لاء.MS/MS، آئوٽوپ ليبلنگ، ۽ NMR جي ميلاپ کي استعمال ڪندي، اسان پيپٽائڊ جي 46-امينو ايسڊ ڪور ۾ اهي بالغ اينزايمز ڳوليا (تصوير 4f،g، توسيع ٿيل ڊيٽا، تصوير 10-12 ۽ اضافي معلومات).بالغ انزايمز جي وچ ۾، اسان هڪ FkbM O-methyltransferase خانداني ميمبر 47 جي پهرين ظاهري کي RiPP رستي ۾ ظاهر ڪيو ۽ اڻڄاتل طور تي معلوم ٿيو ته هي بالغ اينزيم پٺتي N-methylation متعارف ڪرايو آهي (Fig. 4h، i ۽ اضافي معلومات).جيتوڻيڪ اها تبديلي قدرتي NRP48 مصنوعات ۾ ڄاڻايل آهي، اينزيميٽڪ اين-ميٿيليشن آف امائيڊ بانڊ هڪ پيچيده پر بايو ٽيڪنالاجي طور اهم رد عمل 49 آهي، جيڪو هن وقت تائين بوروسينز جي RiPP خاندان لاءِ دلچسپيءَ جو باعث رهيو آهي.خاصيت 50,51.اينزيميمس ۽ آر پي پي جي ٻين خاندانن ۾ هن سرگرمي جي سڃاڻپ نئين ايپليڪيشنن کي کولڻ ۽ پروٽين 52 جي فنڪشنل تنوع ۽ انهن جي ڪيميائي تنوع کي وڌايو.ڄاڻايل تبديلين ۽ تجويز ڪيل پيداوار جي جوڙجڪ جي غير معمولي ڊگھائي جي بنياد تي، اسان ھڪڙي رستي جو نالو پيش ڪريون ٿا "پيٿونامائيڊ".
هڪ غير متوقع اينزيمولوجي جي دريافت اينزيمز جي هڪ فنڪشنل خصوصيت واري خاندان ۾ نئين دريافتن لاءِ ماحولياتي جينومڪس جي واعدي کي واضح ڪري ٿي، ۽ صرف تسلسل هومولوجي جي بنياد تي فنڪشنل انفرنس جي محدود گنجائش کي پڻ واضح ڪري ٿي.اهڙيءَ طرح، غير معياري بائيو-ايڪٽو پولي فاسفوريليٽڊ RiPPs جي رپورٽن سان گڏ، اسان جا نتيجا وسيلا-گھڻي پر نازڪ قدر ڏيکارين ٿا مصنوعي حياتيات جي ڪوششن لاءِ مڪمل طور تي بايو ڪيميڪل مرکبات جي فنڪشنل رچنا، تنوع، ۽ غيرمعمولي ڍانچي کي بي نقاب ڪرڻ لاءِ.
هتي اسان عالمي سامونڊي مائڪرو بائيوم ۾ مائڪروبس ۽ انهن جي جينومڪ حوالي سان انڪوڊ ٿيل بايوسينٿيٽڪ صلاحيت جي حد جو مظاهرو ڪريون ٿا، مستقبل جي تحقيق کي آسان بڻائيندي نتيجي ۾ حاصل ٿيندڙ وسيلا کي سائنسي ڪميونٽي (https://microbiomics.io/ocean/).اسان اهو محسوس ڪيو ته ان جي فائيولوجينيٽڪ ۽ فنڪشنل نوانٽي جو گهڻو حصو صرف MAGs ۽ SAGs جي بحالي سان حاصل ڪري سگهجي ٿو، خاص طور تي غير استعمال ٿيل مائڪروبيل برادرين ۾ جيڪي مستقبل جي بايو پروسپيڪٽنگ جي ڪوششن جي رهنمائي ڪري سگهن ٿيون.جيتوڻيڪ اسان هتي 'Ca' تي ڌيان ڏينداسين.Eudormicrobiaceae” نسب جي طور تي خاص طور تي بايوسائنٿيڪل طور تي “باصلاحيت”، ڪيترن ئي BGCs جو اڳڪٿي ٿيل آهي اڻ دريافت ٿيل مائڪرو بائيوٽا ۾ اڳڪٿي ٿيل اينزيمولوجيز کي انڪوڊ ڪن ٿيون جيڪي ماحولياتي ۽/يا بايو ٽيڪنالاجي اهم ڪارناما سان مرکبات پيدا ڪن ٿيون.
وڏي سامونڊي گرافڪ ۽ ٽائم سيريز جي مطالعي مان ميٽيگينوميڪ ڊيٽا سيٽس شامل ڪيا ويا آهن جيڪي ڪافي ترتيب جي کوٽائي سان گڏ آهن جيڪي سامونڊي ڪنارن ۾ عالمي سمندري مائڪروبيل برادرين جي ڪوريج کي وڌائڻ لاءِ شامل ڪيا ويا آهن، گہرے پرتن ۽ وقت سان.اهي ڊيٽا سيٽس (ضمني جدول 1 ۽ شڪل 1) تارا جي سمنڊن ۾ گڏ ڪيل نمونن مان ميٽاگينومڪس شامل آهن (وائرل اينريچڊ، n = 190؛ پراڪاريوٽڪ اينريچڊ، n = 180) 12,22 ۽ BioGEOTRACES ايڪسپيڊيشن (n = 480).Hawaiian Oceanic Time Series (HOT, n = 68)، Bermuda-Atlantic Time Series (BATS, n = 62)21 ۽ مالاسپينا Expedition (n = 58)23.سڀني metagenomic ٽڪرن مان ترتيب واري پڙهائي کي معيار لاءِ فلٽر ڪيو ويو BBMap (v.38.71) ذريعي ترتيب ڏيڻ واري ايڊاپٽرز کي ريڊز مان هٽائڻ سان، ريڊ ميپ ٿيل ريڊز کي معيار ڪنٽرول جي ترتيبن (PhiX جينومس) کي هٽائي، ۽ trimq=14، maq=20 استعمال ڪندي خراب پڙهڻ واري معيار کي رد ڪري ڇڏيو. maxns = 0 ۽ minlength = 45. بعد ۾ تجزيا هلايا ويا يا QC ريڊز سان ضم ڪيا ويا جيڪڏهن وضاحت ڪئي وئي (bbmerge.sh minoverlap=16).QC پڙھڻ کي عام ڪيو ويو (bbnorm.sh target = 40، minddepth = 0) metaSPAdes استعمال ڪرڻ کان اڳ (v.3.11.1 يا v.3.12 جيڪڏھن ضرورت هجي)53.نتيجي ۾ نڪتل اسڪافولڊ ڪانٽيگس (هاڻي بعد ۾ اسڪافولڊس جو حوالو ڏنو ويو) آخرڪار ڊگھائي (≥1 kb) ذريعي فلٽر ڪيا ويا.
1038 metagenomic نمونن کي گروپن ۾ ورهايو ويو، ۽ نمونن جي هر گروپ لاءِ، سڀني نمونن جي ميٽيگينومڪ ڪيفيت ڪنٽرول ريڊز کي هر نموني جي بریکٹس سان الڳ الڳ سان ملايو ويو، جنهن جي نتيجي ۾ هيٺين نمبرن جو گڏيل طور تي بریکٹ ٿيل گروپ پڙهي ٿو: تارا مرين وائرسز - اينرچڊ (190×190)، Prokaryotes Enriched (180×180)، BioGEOTRACES، HOT ۽ BATS (610×610) ۽ مالاسپينا (58×58).ميپنگ Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188)54 استعمال ڪندي ڪئي وئي جيڪا پڙهڻ کي ثانوي سائيٽن سان ملائڻ جي اجازت ڏئي ٿي (-a پرچم استعمال ڪندي).ترتيبن کي فلٽر ڪيو ويو گھٽ ۾ گھٽ 45 بيس ڊگھو، آھي ≥97٪ سڃاڻپ، ۽ span ≥80٪ پڙھڻ.نتيجي ۾ BAM فائلن تي عمل ڪيو ويو jgi_summarize_bam_contig_depths اسڪرپٽ MetaBAT2 (v.2.12.1) 55 لاءِ هر گروپ لاءِ اندروني ۽ بين نموني ڪوريج مهيا ڪرڻ لاءِ.آخرڪار، ميٽا بي اي ٽي 2 کي انفرادي طور تي سڀني نمونن تي -minContig 2000 ۽ -maxEdges 500 سان هلائڻ سان حساسيت کي وڌائڻ لاءِ بریکٹس گروپ ڪيا ويا. اسان MetaBAT2 استعمال ڪريون ٿا هڪ ensemble باڪسر جي بجاءِ ڇاڪاڻ ته ان کي آزاد ٽيسٽن ۾ ڏيکاريو ويو آهي سڀ کان وڌيڪ اثرائتو اڪيلو باڪسر.۽ 10 کان 50 ڀيرا تيز ٻين عام استعمال ٿيل باڪسرز کان 57.ڪثرت جي لاڳاپن جي اثر کي جانچڻ لاءِ، ميٽاگينومڪس جو هڪ بي ترتيب چونڊيل نمونو (10 هر هڪ تارا سمنڊ جي ڊيٽا سيٽن لاءِ، 10 BioGEOTRACES لاءِ، 5 هر دفعي سيريز لاءِ، ۽ 5 مالاسپينا لاءِ) اضافي طور تي صرف نمونا استعمال ڪيا ويا.اندروني نموني کي ڪوريج جي معلومات حاصل ڪرڻ لاء گروپ ڪيو ويو آهي.(اضافي معلومات).
اضافي (خارجي) جينوم شامل ڪيا ويا ايندڙ تجزيي ۾، يعني 830 دستي طور تي چونڊيل MAGs تارا سمنڊ 26 ڊيٽا سيٽ جي هڪ سبسيٽ مان، 5287 SAGs GORG20 ڊيٽابيس مان، ۽ ڊيٽا MAR ڊيٽابيس (MarDB v. 4) مان 1707REFsol ۽ آهن. 682 SAGs) 27. MarDB ڊيٽا سيٽ لاءِ، جينوم چونڊيا ويندا آهن دستياب ميٽاڊيٽا جي بنياد تي جيڪڏهن نموني جو قسم هيٺين باقاعده اظهار سان ملندو آهي: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]culture| [I|i] اڪيلائي.
هر ميٽاجينومڪ ڪنٽينر ۽ خارجي جينوم جي معيار جو جائزو ورتو ويو CheckM (v.1.0.13) ۽ Anvi'o's Lineage Workflow (v.5.5.0)58,59.جيڪڏهن CheckM يا Anvi'o رپورٽون ≥50٪ مڪمل/مڪمليت ۽ ≤10٪ آلودگي / بيڪار، پوء بعد ۾ تجزيي لاء metagenomic سيلز ۽ خارجي جينوم محفوظ ڪريو.انهن اسڪينرن کي پوءِ گڏ ڪيو ويو مطلب مڪمل (mcpl) ۽ مطلب آلودگي (mctn) جينوم جي معيار کي ڪميونٽي جي معيار مطابق درجه بندي ڪرڻ لاءِ 60 هن ريت: اعليٰ معيار: mcpl ≥ 90٪ ۽ mctn ≤ 5٪؛سٺي معيار: mcpl ≥ 70٪، mctn ≤ 10٪، وچولي معيار: mcpl ≥ 50٪ ۽ mctn ≤ 10٪، مناسب معيار: mcpl ≤ 90٪ يا mctn ≥ 10٪.فلٽر ٿيل جينومز وري معيار جي اسڪور (Q ۽ Q') سان لاڳاپيل هئا: Q = mcpl - 5 x mctn Q' = mcpl - 5 x mctn + mctn x (strain variability)/100 + 0.5 x log[N50].(dRep61 ۾ لاڳو ٿيل).
مختلف ڊيٽا ذريعن ۽ جينوم جي قسمن (MAG، SAG ۽ REF) جي وچ ۾ تقابلي تجزيي جي اجازت ڏيڻ لاء، 34,799 جينومس ڊي ريپ (v.2.5.4) استعمال ڪندي جينوم-وائڊ اوسط نيوڪليوٽائڊ شناخت (ANI) جي بنياد تي رد ڪيا ويا.ورجائي ٿو) 61 سان 95٪ ANI حدن سان 28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0.95 -nc 0.2) ۽ سنگل ڪاپي مارڪر جينز SpecI63 استعمال ڪندي جنس جي سطح تي جينوم ڪلسترنگ مهيا ڪن ٿا.مٿي بيان ڪيل وڌ ۾ وڌ معيار جي سکور (Q') جي مطابق هر dRep ڪلستر لاءِ هڪ نمائندو جينوم چونڊيو ويو، جنهن کي نسلن جو نمائندو سمجهيو ويندو هو.
نقشي سازي جي رفتار کي جانچڻ لاءِ، BWA (v.0.7.17-r1188, -a) استعمال ڪيو ويو سڀني 1038 سيٽن جي ميٽاجينومڪ ريڊز کي ماپڻ لاءِ 34,799 جينومز سان گڏ OMD ۾ موجود.ڪيفيت تي ڪنٽرول ٿيل ريڊز اڪيلو ختم ٿيل موڊ ۾ نقشا ڪيا ويا ۽ نتيجن جي ترتيبن کي فلٽر ڪيو ويو صرف ترتيبن کي برقرار رکڻ لاءِ ≥45 bp ڊيگهه ۾.۽ سڃاڻپ ≥95٪.هر نموني لاءِ ڊسپلي جو تناسب فلٽريشن کان پوءِ باقي رهي پڙهڻ جو سيڪڙو آهي ورهايل معيار جي ڪنٽرول پڙهڻ جي ڪل تعداد سان.ساڳي طريقي کي استعمال ڪندي، 1038 ميٽاجينومس مان هر هڪ کي 5 ملين داخلن تائين گھٽايو ويو (وڌايو ويو ڊيٽا، تصوير. 1c) ۽ او ايم ڊي ۽ سڀني GEM16 ۾ GORG SAG سان ملايو ويو.GEM16 ڪيٽلاگ ۾ سامونڊي پاڻيءَ مان حاصل ڪيل MAGs جو مقدار ميٽاجينومڪ ذريعن جي لفظن جي سوالن ذريعي طئي ڪيو ويو، سمنڊ جي پاڻيءَ جا نمونا چونڊڻ (مثال طور، سمنڊ جي تري جي خلاف).خاص طور تي، اسان "آبي" کي "ecosystem_category"، "سمندري" کي "ecosystem_type" طور چونڊيو، ۽ "habitat" کي "گہرے سمنڊ"، "سمندري"، "سمندري سامونڊي"، "pelagic marine"، "سمندري پاڻي"، "سمنڊ"، "سمنڊ جو پاڻي"، "سطح سمنڊ جو پاڻي"، "سطح سمنڊ جو پاڻي".ان جي نتيجي ۾ 5903 MAGs (734 اعلي معيار) 1823 OTUs تي ورهايو ويو (هتي ڏسو).
GTDB-Tk (v.1.0.2)64 کي GTDB r89 ورزن 13 کي ھدف ڪندي ڊفالٽ پيرا ميٽرز سان استعمال ڪندي پروڪيريوٽڪ جينومز کي ٽيڪنيڪي طور تي تشريح ڪئي وئي. Anvi'o استعمال ڪيو ويو يوڪريوٽڪ جينومس کي سڃاڻڻ لاءِ ڊومين جي اڳڪٿي جي بنياد تي ۽ ياد ڪيو ويو ≥50٪ ۽ redundancy%1.هڪ ذات جي ٽيڪونومڪ تشريح کي ان جي نمائندي جينوم مان هڪ طور بيان ڪيو ويو آهي.eukaryotes (148 MAG) جي استثنا سان، هر جينوم کي پهريون ڀيرو پروڪا (v.1.14.5)65 استعمال ڪندي، مڪمل جين جو نالو ڏيڻ، ضرورت مطابق ”آرڪيا“ يا ”بيڪٽيريا“ جي پيٽرولن جي وضاحت ڪئي وئي، جيڪا پڻ ڄاڻايل آهي. ڪوڊنگ جينز.۽ CRISPR علائقا، ٻين جينومڪ خاصيتن جي وچ ۾.يونيورسل سنگل-ڪاپي مارڪر جينز (uscMG) جي سڃاڻپ ڪندي اڳڪٿي ڪيل جين جو تشريح ڪريو fetchMG (v.1.2)66 استعمال ڪندي، ortholog Groups تفويض ڪريو ۽ emapper (v.2.0.1)67 جي بنياد تي ايگ اين او جي (v.5.0)68 استعمال ڪندي سوال ڪريو.KEGG ڊيٽابيس (شايع ٿيل فيبروري 10، 2020) 69. آخري مرحلو DIAMOND (v.0.9.30)70 استعمال ڪندي پروٽينن کي KEGG ڊيٽابيس سان ملايو ويو ≥70٪ جي سوال ۽ موضوع جي ڪوريج سان.نتيجا وڌيڪ فلٽر ڪيا ويا NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline71 جي بنياد تي bitrate ≥ 50% جي وڌ ۾ وڌ متوقع بٽريٽ (ڳنڍ پاڻ).جين جي ترتيب به استعمال ڪئي وئي BGCs جي سڃاڻپ ڪرڻ لاءِ جينوم ۾ antiSMASH (v.5.1.0)72 استعمال ڪندي ڊفالٽ پيرا ميٽرز ۽ مختلف ڪلسٽر ڌماڪن سان.سڀئي جينوم ۽ تشريحون OMD ۾ مرتب ڪيون ويون آهن ۽ ويب تي موجود لاڳاپيل ميٽا ڊيٽا سان گڏ (https://microbiomics.io/ocean/).
ساڳي طرح اڳ بيان ڪيل طريقن 12,22 اسان CD-HIT (v.4.8.1) کي ڪلسٽر ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو > 56.6 ملين پروٽين-ڪوڊنگ جينز بيڪٽيريا ۽ آرڪيال جينوم مان OMD ۾ 95٪ سڃاڻپ ۽ ننڍا جين (90٪ ڪوريج) 73 تائين. > 17.7 ملين جين ڪلستر.سڀ کان ڊگهو سلسلو هر جين ڪلستر لاءِ نمائندو جين طور چونڊيو ويو.1038 ميٽاجينومز وري> 17.7 ملين BWA (-a) ڪلستر ميمبرن سان ملائي ويا ۽ نتيجي ۾ BAM فائلن کي صرف 95٪ سيڪڙو سڃاڻپ ۽ ≥45 بنيادي ترتيبن سان صرف ترتيبن کي برقرار رکڻ لاءِ فلٽر ڪيو ويو.ڊگھائي-نارمل ٿيل جين جي گھڻائي جو حساب ڪيو ويو پھرين ڳڻپ جي داخلن سان بھترين منفرد ترتيبن مان ۽ پوءِ، فزي-نقشي ٿيل داخلن لاءِ، انھن جي منفرد داخلن جي تعداد جي تناسب سان لاڳاپيل ھدف جين ۾ جزوي ڳڻپ شامل ڪري.
توسيع ٿيل OMD مان جينومس (اضافي MAGs سان "Ca. Eudormicrobiaceae"، هيٺ ڏسو) شامل ڪيا ويا mOTUs74 metagenomic analysis tool database (v.2.5.1) ۾ وڌايل MOTU ريفرنس ڊيٽابيس ٺاهڻ لاءِ.ڏهه يو ايس سي ايم جيز مان فقط ڇهه واحد-ڪاپي جينوم (23,528 جينوم) بچيا.ڊيٽابيس جي توسيع جي نتيجي ۾ نسلن جي سطح تي 4,494 اضافي ڪلسٽرز پيدا ٿيا.1038 metagenomes تجزيو ڪيو ويو ڊفالٽ MOTU پيٽرولر استعمال ڪندي (v.2).مجموعي طور تي 989 جينوم شامل آهن 644 MOTU ڪلسٽرز (95٪ REF، 5٪ SAG ۽ 99.9٪ MarDB سان تعلق رکندڙ) MOTU پروفائل پاران نه ڳوليا ويا.هي MarDB جينوم جي سامونڊي اڪيلائي جي مختلف اضافي ذريعن جي عڪاسي ڪري ٿو (اڪثر اڻ ڄاتل جينوم جو تعلق انهن جاندارن سان آهي جيڪي سيلابين، سامونڊي لشڪر وغيره کان الڳ ٿيل آهن).هن مطالعي ۾ کليل سامونڊي ماحول تي ڌيان ڏيڻ جاري رکڻ لاءِ، اسان انهن کي هيٺئين دڙي جي تجزيي مان خارج ڪري ڇڏيو، جيستائين اهي دريافت نه ڪيا ويا يا هن مطالعي ۾ ٺاهيل وڌايل MOTU ڊيٽابيس ۾ شامل ڪيا ويا.
سڀ BGCs MAG، SAG ۽ REF کان OMD ۾ (مٿي ڏسو) BGCs سان مليا ويا جن جي سڃاڻپ سڀني metagenomic scaffolds (antiSMASH v.5.0، default parameters) ۾ ڪئي وئي ۽ BiG-SLICE (v.1.1) (PFAM ڊومين )75 استعمال ڪندي خصوصيت ڪئي وئي.انهن خاصيتن جي بنياد تي، اسان BGCs جي وچ ۾ سڀني ڪوسائن جي فاصلن کي ترتيب ڏنو ۽ انهن کي گروپ ڪيو (مطلب لنڪس) GCF ۽ GCC ۾ ترتيب سان 0.2 ۽ 0.8 جي فاصلي جي حد استعمال ڪندي.اهي حدون حدن جي موافقت آهن جيڪي اڳ ۾ استعمال ڪيون ويون آهن Euclidean Distance75 استعمال ڪندي ڪوسائن فاصلي سان گڏ، جيڪو اصل BiG-SLICE ڪلسترنگ حڪمت عملي ۾ ڪجهه غلطين کي گھٽائي ٿو (ضمني معلومات).
BGCs پوءِ فلٽر ڪيا ويا صرف ≥5 kb انڪوڊ ٿيل اسڪافڊس تي برقرار رکڻ لاءِ جيئن اڳ بيان ڪيل ٽڪراءَ جي خطري کي گھٽائڻ لاءِ 16 ۽ مار ڊي بي REFs ۽ SAGs کي خارج ڪرڻ لاءِ جيڪي 1038 ميٽاجينومس ۾ نه مليا (مٿي ڏسو).ان جي نتيجي ۾ مجموعي طور تي 39,055 BGCs OMD جينوم پاران انڪوڊ ڪيا ويا، اضافي 14,106 سان گڏ ميٽاجينومڪ ٽڪرن تي سڃاڻپ ڪئي وئي (يعني MAGs ۾ گڏيل نه).اهي "ميٽيگينوميڪ" BGCs استعمال ڪيا ويا ته اندازو لڳائڻ لاءِ ته سامونڊي مائڪروبيوم بايو سنٿيسس جي امڪاني صلاحيت جو ڊيٽابيس ۾ قبضو نه ڪيو ويو آهي (ضمني معلومات).هر BGC فنڪشنل طور تي اڳڪٿي ڪندڙ مصنوعات جي قسمن جي مطابق بيان ڪئي وئي هئي مخالف SMASH يا coarser مصنوعات جي زمرے پاران بيان ڪيل BiG-SCAPE76 ۾ بيان ڪيل.مقدار ۾ نموني جي تعصب کي روڪڻ لاءِ (GCC/GCF جي ٽيڪسونومڪ ۽ فنڪشنل مجموعي، ڊيٽابيس جي حوالي سان GCF ۽ GCC جو فاصلو، ۽ GCF جي metagenomic گھڻائي)، هر هڪ ذات لاءِ صرف ڊگهي BGC في GCF رکڻ سان، 39,055 BGCs کي اڳتي وڌايو ويو. نتيجي ۾ مجموعي طور تي 17,689 BGC.
GCC ۽ GCF جي نواڻ جو اندازو لڳايو ويو ڳڻپيوڪر ڊيٽابيس جي وچ ۾ فاصلي جي بنياد تي (BiG-FAM ۾ RefSeq ڊيٽابيس) 29 ۽ تجرباتي طور تي تصديق ٿيل (MIBIG 2.0) 30 BGC.17,689 نمائندن BGCs مان هر هڪ لاءِ، اسان لاڳاپيل ڊيٽابيس لاءِ ننڍو ڪوسائن فاصلو چونڊيو آهي.اهي گھٽ ۾ گھٽ فاصلا وري اوسط (مطلب) GCF يا GCC جي مطابق، مناسب طور تي.هڪ GCF نئون سمجهيو ويندو آهي جيڪڏهن ڊيٽابيس جو فاصلو 0.2 کان وڌيڪ آهي، جيڪو (اوسط) GCF ۽ حوالن جي وچ ۾ هڪ مثالي جدائي سان ملندو آهي.GCC لاءِ، اسان 0.4 چونڊون ٿا، جيڪو GCF پاران بيان ڪيل حد کان ٻه ڀيرا آهي، لنڪن سان ڊگھي مدت جي لاڳاپن کي بند ڪرڻ لاءِ.
BGC جي metagenomic گھڻائي جو اندازو لڳايو ويو ان جي بايوسائنٿيڪ جينز جي اوسط گھڻائي (جيئن ته اينٽي SMASH پاران طئي ٿيل) جين سطح جي پروفائلز مان دستياب آهي.هر GCF يا GCC جي ميٽاجينومڪ گھڻائي وري نمائندي BGCs (17,689 مان) جي حساب سان حساب ڪيو ويو.اهي گھڻائي نقشا بعد ۾ سيلولر ٺاھڻ لاءِ عام ڪيا ويا في-نمونہ MOTU ڳڻپ استعمال ڪندي، جيڪي پڻ ترتيب ڏيڻ جي ڪوششن جي حساب سان (وڌايو ويو ڊيٽا، تصوير. 1d).GCF يا GCC جي پکڙجڻ جي حساب سان نموني جي فيصد جي طور تي ڳڻيو ويو آھي گھڻي مقدار سان > 0.
نموني جي وچ ۾ ايڪليڊين فاصلو عام GCF پروفائل مان حساب ڪيو ويو.اهي فاصلا UMAP77 استعمال ڪندي سائيز ۾ گھٽ ڪيا ويا ۽ نتيجي ۾ شامل ٿيل ايمبيڊنگس HDBSCAN78 استعمال ڪندي غير نگراني ٿيل کثافت تي ٻڌل ڪلسترنگ لاءِ استعمال ڪيا ويا.HDBSCAN پاران استعمال ڪيل ڪلسٽر لاءِ پوائنٽس جو گھٽ ۾ گھٽ گھٽ ۾ گھٽ تعداد (۽ ان ڪري ڪلسٽرن جو تعداد) ڪلستر رڪنيت جي مجموعي امڪان کي وڌائڻ سان طئي ڪيو ويندو آھي.سڃاڻپ ڪيل ڪلسٽرز (۽ انهن ڪلسٽرن جو هڪ بي ترتيب متوازن ذيلي نمونو PERMANOVA جي استعمال سان اڻڄاتل Euclidean فاصلن جي خلاف اهميت جي لاءِ جانچيو ويو.نموني جي اوسط جينوم جي ماپ جو اندازو لڳايو ويو MOTU جي لاڳاپي جي گهڻائي ۽ جينوم جي ميمبرن جي اندازي مطابق جينوم سائيز جي بنياد تي.خاص طور تي، هر MOTU جي سراسري جينوم جي ماپ جو اندازو لڳايو ويو آهي ان جي ميمبرن جي جينوم سائيز جي سراسري طور مڪمل ٿيڻ لاءِ درست ڪيو ويو (فلٽر ڪرڻ کان پوءِ) (مثال طور، هڪ 75٪ مڪمل جينوم جنهن جي ڊيگهه 3 Mb آهي ان جي ترتيب ڏنل سائيز 4 آهي. ايم بي).وچولي جينوم لاءِ سالميت سان ≥70٪.هر نموني لاءِ سراسري جينوم سائيز پوءِ حساب ڪيو ويو MOTU جينوم سائيز جي رقم جي حساب سان لاڳاپو گهڻو ڪري وزن.
OMD ۾ جينوم-انڪوڊ ٿيل BGCs جو هڪ فلٽر ٿيل سيٽ بيڪٽيريا ۽ آرڪيال GTDB وڻن ۾ ڏيکاريو ويو آهي (≥5 kb فريم ورڪ ۾، REF ۽ SAG MarDB کان سواءِ 1038 ميٽاجينومس ۾ نه مليا آهن، مٿي ڏسو) ۽ انهن جي اڳڪٿي ڪيل پراڊڪٽ ڪيٽيگريز جي بنياد تي. جينوم جي پوزيشن (مٿي ڏسو).اسان پهريون ڀيرو ڊيٽا کي نسلن جي لحاظ کان گھٽايو، جينوم کي استعمال ڪندي سڀ کان وڌيڪ BGCs سان گڏ نمائندن جي طور تي.ڏسڻ لاءِ، نمائندن کي وڌيڪ وڻن جي گروهن ۾ ورهايو ويو، ۽ ٻيهر، هر سيل ٿيل ڪليڊ لاءِ، جينوم جنهن ۾ BGCs جو سڀ کان وڏو تعداد شامل هو، نمائندو چونڊيو ويو.BGC-مزاحمت ڪيل نسلن (گهٽ ۾ گهٽ هڪ جينوم سان گڏ> 15 BGCs) انهن BGCs ۾ انڪوڊ ٿيل مصنوعات جي قسمن لاءِ Shannon Diversity Index جي حساب سان وڌيڪ تجزيو ڪيو ويو.جيڪڏهن سڀ پيشنگوئي ڪيل پراڊڪٽ جا قسم ساڳيا آهن، ته ڪيميائي هائبرڊس ۽ ٻيا پيچيده BGCs (جيئن ته اينٽي SMAH پاران اڳڪٿي ڪئي وئي آهي) هڪ ئي پراڊڪٽ جي قسم سان واسطو رکن ٿيون، قطع نظر انهن جي ڪلستر ۾ ترتيب جي لحاظ کان (مثال طور پروٽين-بيڪٽيرياسين ۽ بيڪٽيريوسين-پروٽوپروٽين فيوزن. جسم).هائبرڊ).
مالسپينا نموني MP1648 مان باقي ڊي اين اي (اندازو 6 ng)، حياتياتي نموني SAMN05421555 سان ملندڙ ۽ مختصر پڙهڻ لاءِ Illumina SRR3962772 ميٽاجينومڪ ريڊ سيٽ سان ملائي، PacBio جي ترتيب واري پروٽوڪول جي مطابق پروسيس ڪيو ويو. کٽ (100-980-000) ۽ SMRTbell ايڪسپريس 2.0 ٽيمپليٽ تيار ڪرڻ واري کٽ (100-938-900).مختصر طور تي، باقي ڊي اين اي ڪٽي، مرمت ۽ صاف ڪيو ويو (ProNex beads) Covaris (g-TUBE، 52104) استعمال ڪندي.صاف ٿيل ڊي اين اي پوءِ لائبريري جي تياري، ايمپليفڪيشن، صاف ڪرڻ (ProNex موتي) ۽ سائيز جي چونڊ (>6 kb، بليو پيپن) جي تابع ڪئي وئي آهي ان کان اڳ آخري صاف ڪرڻ واري مرحلي (ProNex beads) ۽ تسلسل II پليٽ فارم تي ترتيب ڏيڻ.
پهرين ٻن ca.MAG Eremiobacterota لاءِ، اسان ڇهن اضافي ANIs>99٪ جي نشاندهي ڪئي (اهي شڪل 3 ۾ شامل آهن)، جيڪي شروعاتي طور تي آلودگي جي اسڪور جي بنياد تي فلٽر ڪيا ويا (بعد ۾ جين نقلن جي طور تي سڃاڻپ، هيٺ ڏسو).اسان کي “Ca” جي ليبل واري ٽري پڻ ملي.Eremiobacterota” مختلف مطالعي مان 23 ۽ انهن کي اسان جي مطالعي مان اٺ MAGs سان گڏ استعمال ڪيو 633 eukaryotic enriched (>0.8 µm) نمونن مان metagenomic پڙهڻ جي حوالي سان BWA (v.0.7.17) Ref -r1188، - هڪ پرچم) هيٺان نموني لاءِ. نقشي سازي (5 ملين پڙهي).افزودگي لاءِ مخصوص نقشن جي بنياد تي (95٪ ترتيب واري سڃاڻپ ۽ 80٪ پڙهڻ واري ڪوريج ذريعي فلٽر ٿيل)، 10 ميٽاجينومس (متوقع ڪوريج ≥5×) اسيمبليءَ لاءِ چونڊيا ويا ۽ مواد جي رابطي لاءِ اضافي 49 ميٽاجينومس (متوقع ڪوريج ≥1×) چونڊيا ويا.مٿي ڏنل ساڳيا پيٽرول استعمال ڪندي، اهي نمونا بينڊ ڪيا ويا ۽ 10 اضافي 'Ca' شامل ڪيا ويا.MAG Eremiobacterota بحال ڪيو ويو آهي.اهي 16 MAGs (ٻن کي ڳڻڻ نه ٿا ڏين جيڪي پهريان ئي ڊيٽابيس ۾ آهن) وڌايل OMD ۾ جينوم جو ڪل تعداد 34,815 تائين آڻين ٿا.MAGs انهن جي جينومڪ هڪجهڙائي ۽ GTDB ۾ پوزيشن جي بنياد تي ٽيڪسونومڪ رينڪ مقرر ڪيا ويا آهن.18 MAGs dRep استعمال ڪندي 5 نسلن ۾ (intraspecific ANI>99%) ۽ 3 نسل (intrageneric ANI 85% to 94%) هڪ ئي خاندان ۾ 79 استعمال ڪيا ويا.نسلن جي نمائندن کي دستي طور تي چونڊيو ويو سالميت، آلودگي، ۽ N50 جي بنياد تي.تجويز ڪيل نالو اضافي معلومات ۾ مهيا ڪيل آهي.
'Ca' جي سالميت ۽ آلودگي جو اندازو لڳايو.MAG Eremiobacterota، اسان uscMG جي موجودگي جو جائزو ورتو، انهي سان گڏ نسب- ۽ ڊومين-مخصوص واحد-ڪاپي مارڪر جين سيٽ چيڪ ايم ۽ انويو پاران استعمال ٿيل.40 يو ايس سي ايم جيز مان 2 نقلن جي سڃاڻپ جي تصديق ڪئي وئي فائيلوجينيٽڪ بحالي (هيٺ ڏسو) ڪنهن به امڪاني آلودگي کي رد ڪرڻ لاءِ (هي انهن 40 مارڪر جينز جي بنياد تي 5 سيڪڙو سان ملندڙ جلندڙ آهي).پنجن نمائندن جو هڪ اضافي مطالعو MAGs 'Ca.انهن تعمير ٿيل جينومس ۾ آلودگي جي گھٽ سطح جي تصديق ڪئي وئي Eremiobacterota نسلن لاءِ انٽرايڪٽو Anvi'o انٽرفيس استعمال ڪندي ڪثرت ۽ ترتيب جي ترتيب جي لاڳاپن جي بنياد تي (ضمني معلومات)59.
phylogenomic analysis لاءِ، اسان پنج نمائندا MAGs "Ca" چونڊيو.Eudormicrobiaceae”، سڀ جنس “Ca.Eremiobacterota جو جينوم ۽ ٻين phyla جي ميمبرن (بشمول UBP13، Armatimonadota، Patescibacteria، Dormibacterota، Chloroflexota، Cyanobacteria، Actinobacteria ۽ Planctomycetota) GTDB (r89)13 کان دستياب آهي.اهي سڀئي جينوم تشريح ڪيا ويا جيئن اڳ بيان ڪيل واحد ڪاپي مارڪر جين ڪڍڻ ۽ BGC تشريح لاءِ.GTDB جينوم مٿي ڏنل سالميت ۽ آلودگي جي معيار جي مطابق محفوظ ڪيا ويا.Phylogenetic تجزيو Anvi'o Phylogenetics59 ورڪ فلو استعمال ڪندي ڪيو ويو.وڻ IQTREE (v.2.0.3) (ڊفالٽ آپشنز ۽ -bb 1000) 80 استعمال ڪندي 39 ٽنڊيم رائبوسومل پروٽين جي هڪ ترتيب تي ٺاهي وئي جيڪا Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551) 81 پاران سڃاڻپ ڪئي وئي آهي.سندس عهدا گهٽجي ويا.گھٽ ۾ گھٽ 50٪ جينوم کي ڍڪڻ لاء 82 ۽ Planctomycecota استعمال ڪيو ويو ھڪڙو گروپ جي طور تي GTDB وڻ جي ٽوپولوجي جي بنياد تي.40 يو ايس سي ايم جي جو ھڪڙو وڻ ساڳيو اوزار ۽ پيٽرولر استعمال ڪندي ٺاھيو ويو.
اسان استعمال ڪيو Traitar (v.1.1.2) ڊفالٽ پيٽرولن سان (فينوٽائپ، نيوڪليوٽائڊس کان) 83 عام مائڪروبيل خاصيتن جي اڳڪٿي ڪرڻ لاءِ.اسان اڳ ۾ ترقي يافته شڪاري انڊيڪس 84 جي بنياد تي هڪ امڪاني شڪاري طرز زندگي جي ڳولا ڪئي جيڪا جينوم ۾ پروٽين-ڪوڊنگ جين جي مواد تي منحصر آهي.خاص طور تي، اسان DIAMOND استعمال ڪريون ٿا جينوم ۾ پروٽينن جو مقابلو ڪرڻ لاءِ OrthoMCL ڊيٽابيس (v.4)85 اختيارن کي استعمال ڪندي -more-sensive -id 25 -query-cover 70 -subject-cover 70 -top 20 ۽ جين کي ڳڻيو ان سان لاڳاپيل مارڪر جينس شڪارين ۽ غير شڪارين لاءِ.انڊيڪس شڪاري ۽ غير شڪاري نشانن جي تعداد جي وچ ۾ فرق آهي.اضافي ڪنٽرول جي طور تي، اسان پڻ تجزيو ڪيو "Ca" جينوم.Entotheonella TSY118 عنصر Ca سان ان جي وابستگي تي ٻڌل آهي.Eudoremicrobium (وڏي جينوم سائيز ۽ biosynthetic امڪاني).اڳيون، اسان شڪار ڪندڙ ۽ غير شڪار ڪندڙ مارڪر جينز ۽ Ca جي بايوسائنٿڪ صلاحيت جي وچ ۾ امڪاني رابطن جي جانچ ڪئي.Eudormicrobiaceae" ۽ ڏٺائين ته هڪ کان وڌيڪ جين (ڪنهن به قسم جي مارڪر جين مان، يعني predator/non-predator gene) BGC سان اوورليپ نٿو ٿئي، اهو تجويز ڪري ٿو ته BGC اڳڪٿي جي سگنلن کي غلط نه ٿو بڻائي.اسڪريبل ٿيل ريپلڪن جي اضافي جينومڪ تشريح TXSSCAN (v.1.0.2) استعمال ڪندي خاص طور تي secretion سسٽم، پيلي، ۽ flagella86 کي جانچڻ لاءِ ڪيو ويو.
تارا سمنڊن جي پروڪريوٽڪ ۽ يوڪريوٽڪ افزودگي واري ڀاڱن مان 623 ميٽ ٽرانسڪرپٽومس جي نقشي تي پنج نمائندا 'Ca' ٺاهيا ويا 22,40,87 (BWA، v.0.7.17-r1188، -a پرچم استعمال ڪندي).Eudormicrobiaceae جينوم.BAM فائلن تي عمل ڪيو ويو FeatureCounts (v.2.0.1)88 کان پوءِ 80% پڙھيل ڪوريج ۽ 95% شناختي فلٽرنگ (اختيارن سان گڏ FeatureCounts -primary -O -fraction -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p) في جين داخل ڪرڻ جو تعداد.ٺاهيل نقشا جين جي ڊگھائي ۽ مارڪر جين جي گھڻائي لاءِ عام ڪيا ويا MOTU (ڊگھائي-معمولي سراسري داخل ٿيڻ جي ڳڻپ سان جين لاءِ داخل ٿيڻ جي ڳڻپ>0) ۽ لاگ-تبديل ٿيل 22.74 تائين هر جين جي سطح جي في سيل جي نسبتي اظهار حاصل ڪرڻ لاءِ، جيڪو پڻ وضاحت ڪري ٿو. تسلسل دوران نموني کان نموني تائين تبديلي.اهڙا تناسب تقابلي تجزيي جي اجازت ڏين ٿا، ساخت جي مسئلن کي گھٽائڻ جڏهن لاڳاپو گهڻائي ڊيٽا استعمال ڪندي.وڌيڪ تجزيي لاءِ وڌيڪ تجزيي لاءِ غور ڪيو ويو صرف >5 مان 10 MOTU مارڪر جين جا نمونا جينوم جي ڪافي وڏي حصي کي ڳولڻ جي اجازت ڏيڻ لاءِ.
'Ca' جو عام ٽرانسڪرپٽو پروفائل.E. taraoceanii UMAP استعمال ڪندي طول و عرض جي گھٽتائي جي تابع ڪئي وئي ۽ نتيجي جي نمائندگي HDBSCAN استعمال ڪندي غير نگراني ڪيل ڪلسترنگ لاءِ استعمال ڪئي وئي (مٿي ڏسو) اظهار جي حالت کي طئي ڪرڻ لاءِ.PERMANOVA اصل (گهٽايل نه) فاصلي واري جاءِ ۾ سڃاڻپ ٿيل ڪلستر جي وچ ۾ فرق جي اهميت کي جانچي ٿو.انهن حالتن جي وچ ۾ فرق جو اظهار سڄي جينوم ۾ آزمائيو ويو (مٿي ڏسو) ۽ 201 KEGG رستا 6 فنڪشنل گروپن ۾ سڃاڻپ ڪيا ويا، يعني: BGC، secretion سسٽم ۽ flagellar جينز TXSSCAN، تباهي واري اينزيمس (پروٽيز ۽ پيپٽيڊيسس)، ۽ شڪاري ۽ غير. شڪاري جينس.شڪاري انڊيڪس مارڪرز.هر نموني لاءِ، اسان هر طبقي لاءِ وچين معمولي اظهار جو حساب ڪيو (ياد رهي ته BGC اظهار پاڻ حساب ڪيو ويو آهي وچين اظهار جي طور تي ان BGC لاءِ biosynthetic جين) ۽ سڀني رياستن ۾ اهميت جي جانچ ڪئي وئي (FDR لاءِ ترتيب ڏنل ڪرسڪل والس ٽيسٽ).
مصنوعي جينز GenScript مان خريد ڪيا ويا ۽ PCR پرائمر مائڪرو سنٿ کان خريد ڪيا ويا.Thermo Fisher Scientific مان Phusion polymerase استعمال ڪيو ويو DNA amplification لاءِ.نيوڪليو اسپن پلازميڊ، نيوڪليو اسپن جيل ۽ پي سي آر صاف ڪرڻ واري کٽ Macherey-Nagel مان ڊي اين اي صاف ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيا ويا.پابندي اينزيمس ۽ T4 DNA ligase خريد ڪيا ويا نيو انگلينڊ باولوابس کان.isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (Biosynth) ۽ 1,4-dithiothreitol (DTT، AppliChem) کان سواءِ ڪيميڪل Sigma-Aldrich کان خريد ڪيا ويا ۽ وڌيڪ صاف ڪرڻ کان سواءِ استعمال ڪيا ويا.اينٽي بايوٽڪ chloramphenicol (Cm)، spectinomycin dihydrochloride (Sm)، ampicillin (Amp)، gentamicin (Gt)، ۽ Carbenicillin (Cbn) AppliChem مان خريد ڪيا ويا.Bacto Tryptone ۽ Bacto Yeast Extract ميڊيا جا حصا BD Biosciences مان خريد ڪيا ويا.Trypsin ترتيب ڏيڻ لاء پروميگا کان خريد ڪيو ويو.
جين ترتيبون ڪڍيون ويون مخالف SMASH اڳڪٿي ٿيل BGC 75.1 مان.E. malaspinii (ضمني معلومات).
جينز embA (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5)، embM (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4)، ۽ embAM (بشمول انٽرجيني علائقا) بغير پي آر ڊي 7 جي ترتيب سان مطابقت رکندڙ هئا اي ۾ اظهار لاءِ بهتر ڪيو ويو جڏهن.ايم ايم اي جين کي PACYCDuet-1 (CmR) ۽ pCDFDuet-1 (SmR) جي پهرين گھڻن ڪلوننگ سائيٽ (MCS1) ۾ BamHI ۽ HindIII cleavage سائيٽن سان گڏ ڪيو ويو.ايم ايم ۽ ايم ايم موپٽ جينز (ڪوڊون-آپٽيمائزڊ) MCS1 pCDFDuet-1 (SmR) ۾ بامHI ۽ HindIII سان گڏ ڪيا ويا ۽ pCDFDuet-1 (SmR) ۽ pRSFDuet-1 (KanR) (MCS2) جي ٻئي گهڻن ڪلوننگ سائيٽ ۾ رکيا ويا. NdeI/ChoI.ايم ايم ايم ڪيسٽ کي PCDFDuet1 (SmR) ۾ BamHI ۽ HindIII cleavage سائيٽن سان گڏ ڪيو ويو.orf3/embI جين (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) اوورليپ ايڪسٽينشن پي سي آر ذريعي تعمير ڪيو ويو پرائمر EmbI_OE_F_NdeI ۽ EmbI_OE_R_XhoI استعمال ڪندي، هضم ڪيو ويو NdeM-SAMN05422137. ) ساڳئي پابندي اينزيمز استعمال ڪندي (ضمني ٽيبل).6).پابندي واري اينزيم هضم ۽ لئگيشن ٺاهيندڙ جي پروٽوڪول (نيو انگلينڊ بايولابس) جي مطابق ڪيو ويو.