310 10*1mm اسٽينلیس سٹیل ڪوائلڊ ٽيوبنگ ڪيميائي جز، اسپيڊروئن جا N-ٽرمينل ڊومينز هائيڊروگلز ٺاهين ٿا امائلائيڊ فبرلز تي ٻڌل ۽ پروٽين کي متحرڪ ڪرڻ لاءِ پليٽ فارم مهيا ڪن ٿا.

Nature.com گهمڻ لاءِ توهان جي مهرباني.توھان استعمال ڪري رھيا آھيو برائوزر ورزن محدود CSS سپورٽ سان.بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي بند ڪريو).اضافي طور تي، جاري مدد کي يقيني بڻائڻ لاء، اسان سائيٽ کي بغير اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ ڏيکاريون ٿا.
سلائڊر ڏيکاريندڙ ٽي مضمون في سلائڊ.سلائڊ ذريعي منتقل ڪرڻ لاء پوئتي ۽ ايندڙ بٽڻ استعمال ڪريو، يا هر سلائڊ ذريعي منتقل ڪرڻ لاء آخر ۾ سلائڊ ڪنٽرولر بٽڻ استعمال ڪريو.

تفصيل

310 10 * 1mm اسٽينلیس سٹیل ڪوئلي ٽيوبنگ سپلائرز

ڪيميائي ساخت

مشيني خاصيتون

Recombinant اسپائڊر سلڪ پروٽين (اسپائڊر سلڪ پروٽين) نئين بايوميٽريز جي ترقيءَ ۾ ڪيترائي امڪاني اپليڪشن آهن، پر انهن جي ملٽي موڊل ۽ ايگريگيشن-پرون فطرت انهن کي حاصل ڪرڻ ڏکيو ۽ استعمال ڪرڻ آسان بڻائي ٿي.هتي اسان رپورٽ ڪريون ٿا ته ٻيهر ٺهڪندڙ ننڍو اسپيڊروئن پروٽين ۽، اهم طور تي، اين ٽرمينل ڊومين (NT) پاڻ کي تيزيء سان 37 ° C تي خود مدد ڪندڙ ۽ شفاف هائيڊروجن ٺاهي ٿو.فيوزن پروٽينن تي مشتمل NT ۽ گرين فلوروسنٽ پروٽين يا purine nucleoside phosphorylase مڪمل طور تي ڪم ڪندڙ فيوزن پروٽينن تي مشتمل آهي.هائيڊروجيلس.اسان جا نتيجا ظاھر ڪن ٿا ته recombinant NT ۽ فيوزن پروٽين اعليٰ اظهار جي پيداوار مهيا ڪن ٿا ۽ ھائڊروجلز کي پرڪشش ملڪيتن سان گڏ ڪن ٿا، جھڙوڪ شفافيت، جِليشن کان سواءِ ڪراس لنڪنگ، ۽ اعليٰ کثافت تي فعال پروٽينن جي سڌي متحرڪ ٿيڻ.
ڪڪڙن ۾ ريشم جي غدود جا ست مختلف سيٽ هوندا آهن، هر هڪ مخصوص قسم جو ريشم ٺاهيندو آهي.سموريون ست ريشمي نسلون اسپائيڊر سلڪ پروٽينس (اسپائيڊروئنز) تي مشتمل هونديون آهن لڳ ڀڳ 6000 ريزيڊيو ڊگها ۽ هڪ وڏو مرڪزي ريپٽ علائقو جنهن جي چوڌاري گولائي N- ۽ C-ٽرمينل ڊومينز (NT ۽ CT) 1,2 شامل آهن.ريشم جو سڀ کان وڏي پيماني تي اڀياس ڪيل قسم، پرائمري امپولا، پرائمري امپولا غدود جي پيداوار آهي.هن غدود ۾، epithelial سيلز جو هڪ monolayer اسپائيڊروئن پروٽينن کي گڏ ڪري ٿو ۽ انهن کي غدود جي ليمن ۾ ڳنڍي ٿو، جتي اهي تمام گهڻي مقدار (30-50٪ w/v) 3,4 تي هڪ حليل شڪل (ڊوپنگ) ۾ موجود آهن.غدود ۾ مکيه امپولر اسپيڊروئن پروٽين جي تنظيم ۽ ٺاهه تي بحث ڪيو ويو آهي، پر اڪثر تجرباتي ثبوت ظاهر ڪن ٿا عام طور تي هيليڪل ۽ / يا بي ترتيب هيليڪل ساخت ۽ ميڪلر يا ليميلر ساخت جي موجودگي 5,6,7,8,9,10.جڏهن ته ورجائيندڙ ڊومينز ريشمي فائبرن جي ميڪانياتي خاصيتن کي منظم ڪن ٿا، β-شيٽ نانوڪريسٽل ۽ امورفوس ڍانچي 11,12,13,14,15 ٺاهي رهيا آهن، آخر ڊومينز ريشم جي غدود سان تبديل ٿيندڙ حالتن جي جواب ۾ ريشمي فائبر کي منظم ڪن ٿا 16,17,18.ريشم جي ٺهڻ کي ڪنٽرول ڪندي، 19. ٽرمينل ڊومينز ارتقائي طور تي محفوظ آهن ۽ انهن جو ڪم سڀني اسپيڊروئن پروٽينس 2,20,21 لاءِ عام ٿي سگهي ٿو.غدود مان گذرڻ دوران، اسپائڊروئن جو pH 7.6 کان <5.716 تائين گھٽجي وڃي ٿو ۽ ٿلهي ۽ ٿلهي ٿيڻ واري ڊڪٽ ذريعي حرڪت جي وچ ۾ ڪٽڻ ۽ اسٽريچ سان وڌي ٿو.حل ۾، CT هڪ α-helical Constituto parallel dimer17 آهي، پر گهٽ pH ۽ shear فورسز جي جواب ۾، CT β-layers16، 17 کي ظاهر ڪري ٿو ۽ سوئچ ڪري ٿو، ممڪن طور تي ڪنورٽ 16 جي ورهاڱي وارن علائقن ۾ β-پرتن کي متحرڪ ڪري ٿو. NT هيٺان مونوميرڪ آهن. حالتون جيڪي غدود جي ليمن ۾ حالتن جي عڪاسي ڪن ٿيون ۽ اسپائيڊروئن جي محلوليت ۾ ثالثي ڪن ٿيون، پر پي ايڇ جي گھٽتائي تي، ڪاربوڪسيلڪ ايسڊ سائڊ زنجيرن جي ڪيترن ئي پروٽونيشن کي لڳ ڀڳ 6.5 جي pKa سان NT جي ڊيمرائيزيشن جي طرف وٺي وڃي ٿي، ان ڪري NT کي مستحڪم ڪري ٿو ۽ وڏي مقدار ۾ spidroin کي درست ڪري ٿو. مقدار.نيٽ ورڪ 16,18.اهڙيءَ طرح، NT filament ٺهڻ ۾ هڪ اهم ڪردار ادا ڪري ٿو، ڪوٽنگ ۾ هڪ مونومر کان فائبر 23,24,25 ۾ هڪ ڊائمر ۾ تبديل ٿي.تاريخ 16، 18، 19، 20، 26، 27، 28، 29 تائين اڀياس ڪيل سڀني حالتن جي تحت NT انتهائي حليل ۽ هيليڪل رهي ٿي، جنهن ان جي ترقي کي متاثر ڪيو جيئن هيٽرولوگس پروٽين جي پيداوار لاءِ حلوليت وڌائڻ واري ليبل.
Recombinant ميني اسپائڊر سلڪ پروٽين، جنهن ۾ هڪ NT، هڪ شارٽ ريپيٽ ريجن، هڪ CT، ۽ هڪ His6 ٽيگ (His-NT2RepCT) شامل آهي، پاڻي جي بفر ۾ ايترو ئي حل ٿئي ٿو جيترو ڏيهي اسپائڊر سلڪ پروٽين ۽ ريشمي مکڙي جي اصلي خاصيتن جي نقل ڪري ٿو. .ڪوريج 25.31.هز-NT2RepCT کي بايوميميٽڪ مشين استعمال ڪندي لڳاتار فائبر ۾ ڦٽو ڪري سگھجي ٿو جنهن ۾ هڪ pH 8 سولبل ڪوٽنگ کي پي ايڇ 525,32,33,34,35 واٽر باٿ ۾ ڪڍيو ويندو آهي.E. coli جي Bioreactor خمير جو اظهار ڪندي His-NT2RepCT ۽ بعد ۾ علاج جي نتيجي ۾ صاف ٿيڻ کان پوءِ> 14 g/L پيداوار پيدا ٿي.تيزابيت واري حالتن ۾ سندس-NT2RepCT جي اعلي پيداوار، اعلي حل، ۽ مناسب جواب سڀني کي NT23، 25، 34 ڏانهن منسوب ڪيو ويو آهي.
هتي اسان رپورٽ ڪريون ٿا شفاف هائيڊروجيلز جي تيزيءَ سان ٻيهر ٺهڻ واري اسپيڊروئن پروٽينن مان، بشمول NT اڪيلو، هڪ پروٽين جي حل کي 37 ° C تي انڪيوب ڪندي.thioflavin T fluorescence (ThT)، فورئر ٽرانسفارم انفراريڊ اسپيڪٽروڪوپي (FTIR)، ائٽمي مقناطيسي گونج اسپيڪٽرو اسڪوپي (NMR) ۽ ٽرانسميشن اليڪٽران مائڪرو اسڪوپي (TEM) کي استعمال ڪندي، اسان ڏٺو ته NT ۽ microspider پروٽين، β-sheets ۽ amyloid-like fibrer ۾ ساخت جي تبديليءَ مان گذرن ٿا. جڏهن gels ٺهيل آهن.ان کان علاوه، NT ۽ گرين فلوروسنٽ پروٽين (GFP) يا purine nucleoside phosphorylase (PNP) جا فيوزن پروٽين مڪمل طور تي ڪم ڪندڙ فيوزن ٽڪرن سان گڏ هائيڊروجيل ٺاهيندا آهن.هيٽرولوگس هوسٽن ۾ اعليٰ-ذريعي اظهار، جسماني حالتن هيٺ هائيڊروجيلز جي تيزيءَ سان ٺهڻ سان، انجنيئر ٿيل ڪمن سان هائيڊروجيلز جي قيمتي پيداوار جي امڪان کي کولي ٿو.
سڀ کان وڌيڪ ڄاڻايل recombinant spidroin پروٽين 36 جي برعڪس، His-NT2RepCT Tris-HCl بفر ۾ pH 8 تي مستحڪم آهي ۽ 500 mg/mL تائين ورن کان بغير ٿي سگهي ٿو 25.تنهن ڪري، اسان کي اهو ڏسي حيرت ٿي هئي ته هي پروٽين تيزيءَ سان نظرياتي طور تي صاف، خود مدد ڪندڙ هائيڊروجيلز ٺاهي ٿو جڏهن 37 ° C (Fig. 1b-d) تي پکڙيل آهي.وڌيڪ اڀياس ڏيکاريا ته هز-NT2RepCT جِليشن وڏين رينج ۾ پروٽين جي ڪنسنٽريشن (10-300 mg/mL) تي واقع ٿيا ۽ اهو ڪنسنٽريشن جليشن جي وقت (Fig. 1c ۽ Supplementary Fig. 1) سان جڙيل هو.اهو معلوم ڪرڻ لاءِ ته هز-NT2RepCT جا ڪهڙا حصا هائڊروجل ٺهڻ ۾ وچولي ڪن ٿا، اسان پوءِ هر ڊومين کي انفرادي طور تي جانچيو ۽ مختلف مجموعن ۾ فلاسڪ انورسيشن پرس استعمال ڪندي (شڪل 1a،b).Recombinant spidroin جا سڀ آزمايل حصا 1 h کان گھٽ ۾ جيل ٺاهيا ويا (300 mg/mL جي پروٽين جي ڪنسنٽريشن تي) سواءِ 1 h کان سواءِ 2Rep (Fig. 1b).اهو مشورو ڏئي ٿو ته NT ۽ CT اڪيلو، ميلاپ ۾، يا ٻيهر ورجائڻ سان لاڳاپيل، 37 ° C تي جيل ڪري سگهي ٿو ۽ His6 ٽيگ هن عمل کي ڪنهن به خاص حد تائين متاثر نٿو ڪري.عام تصور کي ڏنو ويو آهي ته NT هڪ انتهائي حليل ۽ مستحڪم پروٽين آهي، ۽ اڳوڻي رپورٽن جي recombinant spidroin هائيڊروجنز جيليشن اثرات کي ورجائي علائقن ۽ / يا CTs ۾ تبديل ٿيندڙ تبديلين ڏانهن منسوب ڪيو آهي، NT پاڻ ڪري سگهي ٿو.جيليشن جي دريافت غير متوقع هئي.ضمني جدول 1) 37، 38، 39. قابل ذڪر، NT اڳ ۾ ئي 10 منٽن اندر ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c) جي ڪنسنٽريشن تي گليل.NT جي مختلف ڪنسنٽريشن سان شيشي جي ڦيرڦار جا تجربا ڏيکاريا ويا ته 50 mg/mL تي NT جو حل سندس-NT2RepCT کان وڌيڪ تيزيءَ سان جڙيل ڪنسنٽريشن تي (w/v، شڪل 1c).
مختلف اسپيڊروئن تعميرات جي اسڪيمياتي نمائندگي هن ڪم ۾ اڀياس ڪئي.b جيل جو وقت 37 °C تي مختلف ريزومبيننٽ اسپيڊروئن پروٽينن لاءِ (300 mg/mL) شيشي کي الٽي ڪندي تصديق ڪئي وئي.CT جيل فوري طور تي انڪوبيشن کان سواءِ (<300 mg/mL)، 2Rep precipitates (300 mg/mL، 5 mm اسڪيل).c جيل ٽائيم سندس-NT2RepCT ۽ NT جو اشارو پروٽين جي ڪنسنٽريشن تي 37 ° C تي.d سندس-NT2RepCT ۽ NT هائيڊروجيلز جون تصويرون اسپائڊر سان ۽ هيٺان ڇپيل خط ”NT“ ترتيب سان (ٻئي 200 mg/mL، اسڪيل بار 5 mm).
هائيڊروجيلز جيڪي مختلف ريزومبيننٽ اسپائيڊروئن پروٽينن سان ٺهندا آهن، انهن جا رنگ ٿورا مختلف هوندا آهن، ۽ ننگي اکين جو مشاهدو شفافيت جا مختلف درجا ڏيکاريندو آهي (تصوير 1b).NT جيل غير معمولي طور تي واضح آهن جڏهن ته ٻيا جيل مبهم ٿي ويندا آهن.سندس-NT2RepCT ۽ NT جيل سلنڊريڪل ٽيوب ۾ اڇلائي سگھجن ٿا (Fig. 1d).
جانچڻ لاءِ ته ڇا قدرتي اسپائڊر ريشم جي ڪوٽنگن جي جيل حالتن جي تحت هاڻي ٻيهر پيدا ٿيندڙ اسپائيڊروئن پروٽين جي جليشن جو سبب بڻجن ٿا، ڪوٽنگون سويڊش برج اسپائڊر (Larinioides sclopetarius) جي وڏي امپولا غدود مان گڏ ڪيون ويون.ڪوٽنگون 20 mM Tris-HCl بفر ۾ 50 mg/mL تي محفوظ ڪيون ويون (ماپيل خشڪ وزن جي بنياد تي)، پر 21 ڏينهن جي انڪيوبيشن دوران 37 °C (ضمني شڪل 2a).
انهن جيلن جي مقدار کي طئي ڪرڻ لاءِ، ريولوجيڪل ماپون استعمال ڪري سگھجن ٿيون جيليشن جي عمل کي مطالع ڪرڻ ۽ مجموعي ميخانياتي ملڪيتن کي طئي ڪرڻ لاءِ.خاص طور تي، بلند درجه حرارت تي اسٽوريج ماڊيولس (لچڪدار) جي نگراني ڪرڻ سان gelling جي گرمي پد تي معلومات مهيا ڪري سگهي ٿي ۽ گڏوگڏ ڪوٽنگ جي viscoelastic ملڪيت.گرمي پد وڌڻ جا تجربا (1°C/min at 25-45°C استعمال ڪندي، اڳئين مطالعي جي بنياد تي قدرتي ريشمي اسٽاڪ حلن جو استعمال ڪندي) 40,41 ڏيکاريو ويو ته His-NT2RepCT ۽ NT حلن جي اسٽوريج ماڊلي گرمي پد وڌڻ سان وڌي وئي.وڌايو ويو (تصوير 2 ۽ ضمني تصوير. 3).خاص طور تي، NT ماڊل سندس-NT2RepCT جي مقابلي ۾ گهٽ درجه حرارت تي وڌڻ شروع ڪيو، تيز جيل وقت سان مطابقت رکي ٿي جڏهن NT سڌو سنئون هز-NT2RepCT سان 37 ° C (شڪل 1).گرمي پد ۾ ايندڙ گهٽتائي کان پوء، اسٽوريج ماڊيولس هيٺين قدرن ڏانهن واپس نه آيو ۽ نقصان جي ماڊيولس کان مٿي رهيو (ڏسو ضمني شڪل 3)، جيڪو حرارتي طور تي ناقابل واپسي مستحڪم جيليشن کي ظاهر ڪري ٿو.جيليشن کان پوءِ، آخري لچڪدار ماڊيولس 15 کان 330 kPa تائين هز-NT2RepCT هائيڊروجيلز لاءِ 100-500 mg/mL جي ڪنسنٽريشن تي، ۽ NT هائيڊروجيلز (100–500 mg/mL) لاءِ آخري لچڪدار ماڊيولس 00-2 کان 241. kPa (تصوير 2 ۽ مڪمل ريمپ ڊيٽا) ڏسو ضمني تصوير 3).
ٿڌڻ سان His-NT2RepCT (300 mg/mL) ۽ b NT (300 mg/mL) جي ماپ دوران درجه حرارت ۾ تبديلي.تير گرمي پد جي رجحان کي ظاهر ڪن ٿا، ۽ اسٽوريج ماڊل ڊيٽا جي لائٽر شيڊنگ کي ڏيکاري ٿو ته اوزار لاء گهٽ ٽورڪ ويلز تي ٽيسٽنگ ٺاهيندڙ طرفان بيان ڪيل آهي، جيڪو وڌندڙ شور جو سبب آهي.c آخر-ماڊول گڏ ڪرڻ His-NT2RepCT ۽ NT جي بلند درجه حرارت کان پوءِ (100, 300, ۽ 500 mg/mL).سڀ ماڊل ريڊنگ 0.1 Hz جي فريڪوئنسي تي ورتو وڃي ٿو.
جيليشن سان جڙيل تبديلين جي تحقيق ڪرڻ لاءِ هڪ امڪاني طريقي جي طور تي، اسان رڪارڊ ڪيو FTIR اسپيڪٽرا جو سندس-NT2RepCT ۽ NT جيليشن کان اڳ ۽ بعد ۾ 37 ° C (Figure 3a,b).جيئن توقع ڪئي وئي، His-NT2RepCT ۽ NT حلن جو اسپيڪٽرا پروٽينن سان مطابقت رکي ٿو α-helix/random coil ثانوي ڍانچي، 1645 cm-1 تي واضح ٿيل بينڊ سان.ٻنهي هائيڊروجيلز لاءِ، جيليشن جي نتيجي ۾ وچولي I بينڊ ۾ اٽڪل 1617 سينٽي-1 ۽ 1695 سينٽي-1 (Fig. 3a، b) ۾ ٻه بازو ٺهي ويا، جيڪي متوازي β-شيٽ جي جوڙجڪ جي ٺهڻ جي نشاندهي ڪن ٿا.انهن تبديلين کي واضح طور تي ٻئي نڪتل ۽ فرق جيليشن اسپيڪٽرا (ضمني شڪل 4b) ۾ پڻ واضح طور تي ڏسي سگهجي ٿو.NT β-پرت جا ٻه بينڊ سندس-NT2RepCT جي ڀيٽ ۾ وڌيڪ واضح هئا، اهو ظاهر ڪري ٿو ته NT هائيڊروجل ۾ β-پرت بينڊ جو ڪل مواد NT2RepCT هائيڊروجيل کان وڌيڪ هو.
سندس-NT2RepCT ۽ b NT جو هڪ FTIR جذب اسپيڪٽرا (ٻئي 500 mg/mL) اڳ (حل) ۽ (جيل) انڪيوبيشن کان پوءِ 37°C تي.c TEM تصويرون ٻيهر معطل ٿيل 50 mg/ml NT2RepCT جيل ۽ ڊي NT.اسڪيل بار 200 nm.هز-NT2RepCT ۽ NT هائيڊروگلز جو فائبر قطر.n = 100 ماپيل فائبر، p <0.0001.نقص بار معياري انحراف ڏيکاري ٿو.نقص بارن جو مرڪز مطلب آھي.انگن اکرن جي تجزيي لاءِ استعمال ڪيو ويو ھڪڙو اڻ ٺھيل ٽي-ٽيسٽ (ٻه-دم).f ThT fluorescence of different recombinant spidroin proteins (100 mg/mL) 37 ° C تي بغير ڇڪڻ جي.g NT (100 mg/mL) 100 mg/mL NT جيل مان 0%، 5%، 10%، ۽ 20% ٻج سان انووليشن جا تجربا.
ٽرانسميشن اليڪٽران مائيڪرو اسڪوپي (TEM) استعمال ڪندي جيل جي تجزيي مان معلوم ٿيو ته هائيڊروجيل امائلائڊ جهڙو فائبرز (Figs. 3c، 3d) تي مشتمل آهي.NT جا ٺهيل فائبر ڊگھا هئا (5-12 nm قطر ۾) ۽ اڻ شاخون، جڏهن ته His-NT2RepCT فائبرز ڊگھي ۾ ننڍا ۽ قطر ۾ وڏيون وڏيون هيون (7-16 nm) (Fig. 3e).انهن نتيجن کي اسان کي اجازت ڏني وئي آهي ته فبروسس جي ڪينيٽيڪس کي استعمال ڪندي thioflavin T (ThT) جي استعمال سان.سڀني recombinant spidroin پروٽينن لاءِ، فلورسنٽ سگنل وڌي ويو جڏهن نمونا 37 °C تي پکڙيل هئا (تصوير 3f، ضمني شڪل 5a).هن ڳولها سان مطابقت، NT ۽ His-NT2RepCT جي خوردبيني معائنو gelling حالتن هيٺ ThT fluorescence ۾ هڪ یکسان اضافو ظاهر ڪيو بغير ThT-مثبت مجموعي جي مقامي جمع (ضمني تصوير 5b،c).ThT-Positive fibrils جي ٺهڻ سان NT ۽ His-NTCT turbidity (ضمني شڪل 5d) ۾ اضافو نه ٿيو، جنهن جو مطلب آهي ته جيل ۾ فائبرلز جو هڪ نيٽ ورڪ جيل جي وضاحت سان سمجهوتو ڪرڻ کان سواءِ ٺاهي سگهي ٿو.اڳ ۾ ٺهيل فائبرن جي ٿوري مقدار ۾ ٻج شامل ڪرڻ سان ڪجهه amyloids 42,43,44 جي fibril ٺهڻ کي تيز ڪري سگهجي ٿو پر NT هائيڊروڪوگولنٽ جي حل ۾ 5%، 10% يا 20% (w/w) NT شامل ڪرڻ سان.ٻج جو اثر (Fig. 3g).شايد ان جو سبب اهو آهي ته هائيڊروجيل ۾ موجود فائبر نسبتاً طئي ٿيل آهن ۽ انهن کي ٻج طور استعمال نٿو ڪري سگهجي.
تيز گرمي پد تي recombinant spidroin پروٽين جي غير متوقع رويي وڌيڪ ائٽمي مقناطيسي گونج (NMR) spectroscopy مطالعي کي جيل ٺهڻ سان لاڳاپيل تبديلين جي سڃاڻپ ڪرڻ لاء اڳتي وڌايو.37 ڊگري سينٽي گريڊ تي وقت سان گڏ رڪارڊ ڪيل His-NT2RepCT حلن جو NMR اسپيڪٽرا ڏيکاريو ويو ته CT اڃا جزوي طور تي فولڊ ٿيل هو، جڏهن ته NT ۽ 2Rep سگنل غائب ٿي چڪا هئا (تصوير 4a)، اهو ظاهر ڪري ٿو ته اهو بنيادي طور تي NT ۽ 2Rep هو، جيڪو جزوي طور تي ڪنٽرول ڪيو ويو هو- NT2RepCT هائيڊروگل.سي ٽي سگنل پڻ ان جي اصلي شدت جي 20٪ تائين گھٽجي ويو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته CT پڻ گهڻو ڪري مقرر ٿيل آهي ۽ هائڊروگل جي جوڙجڪ ۾ شامل ڪيو ويو آهي.CT جي هڪ ننڍڙي حصي لاءِ، جيڪو اڳ ۾ ٺهيل نموني ۾ جيترو موبائيل هوندو آهي ۽ اهڙيءَ طرح حل NMR ذريعي مشاهدو ڪيو ويندو آهي، اسپيڪٽرا ۾ پهرين 10 ڍانچي جي باقيات لاءِ سگنلن جي کوٽ هوندي آهي، ممڪن آهي ته هِز-NT2Rep جي جڙيل حصي جي مشڪل متحرڪ ٿيڻ سبب.اين ايم آر اسپيڪٽرا جي -اسٽيٽ آف هائيڊروجيلز -NT2RepCT α-helices ۽ β-layers جي وڏي موجودگي کي ظاهر ڪيو ۽، ٿوري حد تائين، بي ترتيب ڪوئلي جي جوڙجڪ (تصوير 4b).صرف NT ۾ موجود ميٿيونائن جي باقيات جي ڪيميائي شفٽ جي تجزيي مان ظاهر ٿيو ته هي ڊومين β-شيٽ جي جوڙجڪ ۾ تبديل ٿي چڪو هو.حل ۾ NT جي وقت تي منحصر اسپيڪٽرا سگنل جي شدت ۾ يونيفارم گھٽتائي ڏيکاري ٿي (Fig. 4c)، ۽ NT هائڊروگلز جي سولڊ اسٽيٽ NMR ڏيکاري ٿي ته NT جي باقي بچيل گھڻن کي β-شيٽ جي جوڙجڪ ۾ تبديل ڪيو ويو (تصوير 4d).2Rep جي ٺاھ جوڙ الڳ الڳ مقرر نه ٿي سگھيو آھي ان جي مجموعي جي رجحان جي ڪري.جڏهن ته، NTCT ۽ His-NT2RepCT هائيڊروجيل جي مضبوط حالت NMR اسپيڪٽرا بلڪل هڪجهڙا نظر اچن ٿا (Fig. 4b؛ ضمني تصوير. 6b)، اهو مشورو ڏئي ٿو ته 2Rep هن-NT2RepCT هائيڊروگل جي ساخت واري حصي ۾ ٿورو حصو ڏنو.CT hydrogels لاءِ، α-helices، β-sheets، ۽ بي ترتيب هيليڪل ثانوي ڍانچي موجود هئا (ضمني تصوير. 6d).هن مان معلوم ٿئي ٿو ته CT جا ڪجهه حصا α-helices رهندا آهن جڏهن ته ٻيا β-sheets بڻجي ويندا آهن.اهڙيءَ طرح، NMR اسپيڪٽروڪوپي جا نتيجا ٻڌائين ٿا ته NT هائيڊروجيل ٺهڻ لاءِ اهم آهي ۽ 2Rep ۽ CT سان فيوزن تي هڪ β-شيٽ جي ٺهڻ ۾ پڻ بدلجي ٿو.انهي سان گڏ، اسان تازو ڏٺو آهي ته امڪاني طور تي ايميلوڊ اسپيشل زپون NT ڊومين جي سڀني پنجن هيليڪس ۾ ٺاهيندا آهن، ۽ والٽز الگورٿم پيش ڪيو آهي ته هيلڪس 1 (Fig. 4e).
2D اسپيڪٽرا جو 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT حل کان اڳ (نيرو) ۽ 19 ڪلاڪ انڪيوبيشن کان پوءِ (ڳاڙهو) 37°C تي.ڳاڙهي اسپيڪٽرم ۾ انفرادي ڪراس چوٽيون ۽ نيري اسپيڪٽرم ۾ F24, G136, polyA واحد اکر امينو اسيد جي نشانين ۽ باقين نمبرن سان ظاهر ڪيا ويا آهن.انسيت ڏيکاري ٿو NT، 2Rep، ۽ CT ڊومينز مان چونڊيل بقايا لاءِ وقت تي سگنل جي شدت جو انحصار.b Solid-State radiofrequency (RFDR) اسپيڪٽرا of His-NT2RepCT هائيڊروگلز.RFDR اسپيڪٽرا ۾ مشاهدو ڪيل Cα/Cβ باقيات جا لاڳاپا ماڊل پيپٽائڊ ڪيميائي شفٽ ۽ انگ اکر 82,83 ۽ انهن جي ثانوي جوڙجڪ مان نڪتل قدرن جي مقابلي سان طئي ڪيا ويا.SSB - گھمڻ واري پاسي واري بينڊ.c 15N-HSQC 10 mg/mL NT محلول جو هڪ طرفي اسپيڪٽرا 37 °C تي 36 ڪلاڪن تائين انڪيوبيشن دوران.انسيت وقت جي مقابلي ۾ حجم جي شدت ڏيکاري ٿو.d NT هائيڊروجيلز جو سالڊ اسٽيٽ RFDR اسپيڪٽرا.Cα/Cβ جي رهاڪن جا لاڳاپا ۽ انهن جي ثانوي اڏاوتن کي RFDR اسپيڪٽرا ۾ مشاهدو ڪيو ويو آهي.جپر ڊيٽابيس (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) مان NT45.79 فيبريليشن پروپينسٽي پروفائل جي بنياد تي.Hexapeptide جي مقامي روشنيءَ جي شفٽ ونڊو جي Rosetta توانائي kcal/mol ۾ ڏيکاريل آھي.ڳاڙها بار هيڪسپيپٽائڊس کي ظاهر ڪن ٿا هڪ اعلي فائبروسس جي رجحان سان (Rosetta توانائي هيٺ -23 kcal/mol؛ ڊاٽ ٿيل لڪير کان هيٺ).گرين بارز ٽڪڙن کي ظاهر ڪن ٿا جن سان Rosetta توانائيون حد کان مٿي آهن ۽ ان ڪري اسٽريڪ زپرز ٺاهڻ جو امڪان گهٽ آهي.پرولين تي مشتمل ٽڪرا تجزيي مان خارج ڪيا ويا (ڪالمن کان سواء).اسڪوائر ظاهر ڪري ٿو amyloidosis جي علائقن جي اڳڪٿي ڪئي وئي والٽز الگورٿم 81 (https://waltz.switchlab.org).NT جي امينو اسيد جي باقيات جو سلسلو سڀ کان مٿانهون آهي، ۽ β ثانوي ڍانچي ۾ موجود بقايا جا قسم (سائيڊ اسٽيٽ NMR spectroscopy پاران طئي ٿيل) ڳاڙهي رنگ ۾ ڏيکاريا ويا آهن.پنجن NT α-helices جي پوزيشن کي نامزد ڪيو ويو آھي (H1-H5)28.
پي ايڇ <6.5 تي، ايڇ ٽي ڊيمرائيز ٿي وڃي ٿي، گرميءَ جي مزاحمتي هجڻ ڪري- يا يوريا-انڊس ڊيناچريشن18.وضاحت ڪرڻ لاءِ ته ڪيئن اين ٽي ڊيمرائيزيشن ۽ استحڪام جيليشن تي اثر انداز ٿئي ٿي، 100 mg/ml NT تي مشتمل حل پي ايڇ 8، 7، ۽ 6 تي ڪنٽرول ڪيو ويو وائل انورسيشن ٽيسٽ استعمال ڪندي.NT جا نمونا pH 8 ۽ 7 جيل تي 30 منٽ کان پوءِ 37 ° C تي پکڙجي ويا، پر pH 8 جيل صاف رھي، جڏھن ته pH 7 جيل ھڪ نمايان ترڪيب ڏيکاريو (تصوير 5a).ان جي ابتڙ، pH 6 تي HT تي مشتمل هڪ حل جيل نه ٺهيو، ۽ 20 منٽ کان پوءِ 37 ° C تي هڪ وڏو ورق ڏسي سگهجي ٿو.اهو مشورو ڏئي ٿو ته ڊيمر پاڻ کي ۽ / يا انهن جي اعلي استحڪام جي مقابلي ۾ مونومرز جيليشن کي روڪيندا آهن.پي ايڇ 7 ۽ 6 تي NT لاءِ ترڪيب جي ٺهڻ جي توقع نه ڪئي وئي هئي، ڇاڪاڻ ته اهو ٻڌايو ويو آهي ته NT 200 mg/ml27 تي حل ٿيل آهي، گرمي جي خراب ٿيڻ کان پوءِ آساني سان ٻيهر ٺهي ٿو، ۽ هڪ α-helix پڻ برقرار رکي ٿو. pH 18. انهن اختلافن جي هڪ امڪاني وضاحت اها آهي ته اڳ ۾ ڄاڻايل تجربا ڪمري جي گرمي پد تي يا ان کان گهٽ، يا نسبتاً گهٽ پروٽين جي ڪنسنٽريشن 16,18,19 تي ڪيا ويا هئا.
NT شيشي جي انوريشن ٽيسٽ (100 mg/mL) pH 8, 7, 6 ۽ 154 mM NaCl (pH 8) تي انڪيوبيشن کان پوءِ 37 ° C تي.b NT CD spectra سان ۽ بغير 154 mM NaF ۽ 154 mM NaCl، ترتيب سان.222 nm تي دالر جي بيضوييت قدرتي فولڊ جي تناسب ۾ تبديل ٿي وئي آهي.c NT inversion assay (100 mg/mL) NT* (37 °C ۽ 60 °C)، NTA72R (37 °C)، ۽ His-NT-L6 (37 °C ۽ 60 °C).d NT mutants NT*، NTA72R، ۽ His-NT-L6 جو CD اسپيڪٽرا.222 nm تي دالر جي بيضوييت قدرتي فولڊ جي تناسب ۾ تبديل ٿي وئي آهي.NTFlSp، NTMiSp ۽ گھٽايل NTMiSp (100 mg/mL) جي انورسيشن ٽيسٽ.اسڪيل بار 5 ملي ايم.NT، NTFlSp، NTMiSp ۽ گھٽيل NTMiSp جو CD اسپيڪٽرا.222 nm تي دالر جي بيضوييت قدرتي فولڊ جي تناسب ۾ تبديل ٿي وئي آهي.مڪمل NT اسپيڪٽرا 25 ° C ۽ 95 ° C تي ڏيکاريا ويا آهن ضمني شڪل 8 ۾.
جسماني لوڻ ڪنسنٽريشن NT subunits جي وچ ۾ electrostatic رابطي جو تعين ڪري ٿو ۽ NT جي منتقلي جي dimerization کي هيٺين pH18 ڏانهن.اسان ڏٺو ته 154 ايم ايم NaCl ۽ NaF جي موجودگي واقعي جيليشن کي روڪيو، ترتيب سان (Fig. 5a، b؛ ضمني تصوير. 2b) ۽ اهي نمونا NT monomers جي حرارتي استحڪام کي وڌايو (Fig. 5b، ضمني تصوير. 8) .اهو پڻ مشورو ڏئي ٿو ته استحڪام وڌائڻ، ڊيمرائزيشن جي بدران، جيل ٺهڻ کي روڪي ٿو.
جيليشن ۾ پروٽين جي dimerization ۽ استحڪام جي ڪردار کي وڌيڪ ڳولڻ لاء، اسان ٻه ميوٽنٽ استعمال ڪيو، NT * ۽ NTA72R، جيڪي پڻ گهٽ pH28.30 تي مونوميرڪ رهندا آهن.NT* هڪ ڊبل چارج ريورسل ميوٽنٽ آهي جنهن ۾ مونومر جي ظاهري ڊيپولر چارج ڊسٽريبيوشن کي فليٽ ڪيو ويندو آهي، جيڪو ڊمرائيزيشن کي روڪيندو آهي ۽ انتهائي تيزيءَ سان مونومر جي استحڪام کي وڌائيندو آهي.NTA72R هڪ چارج ٿيل ڊپول آهي، پر Arg-substituted Ala dimer جي حد تي واقع آهي، تنهن ڪري ميوٽيشنز dimerization لاءِ گهربل subunit تعامل ۾ مداخلت ڪن ٿا.37°C تي انڪيوبيشن ڪرڻ تي، NT* هائيڊروجيل نه ٺهيو، جڏهن ته NTA72R 15 منٽ لاءِ هڪ مبهم جيل ٺاهي (Fig. 5c).جيئن ته NT* ۽ NTA72R ٻئي ڊمرائيز نٿا ٿي سگهن پر مونومر جي استحڪام ۾ فرق آهي (Fig. 5d)، اهي نتيجا سختي سان تجويز ڪن ٿا ته اعلي thermodynamic استحڪام NT کي گلڻ کان روڪي ٿو.اهو پڻ انهي حقيقت جي حمايت ڪري ٿو ته HT* هڪ جيل ٺاهيندو آهي جڏهن اهو تيز درجه حرارت تي غير مستحڪم آهي (8 منٽ کان پوء 60 ° C تي؛ تصوير 5c).اهو اڳ ۾ ڏيکاريو ويو آهي ته NT ۾ ميٿيونائن جو اعلي مواد ان جي قدرتي فولڊ کي مائع ڪري ٿو ۽ ڇهه Met to Leu متبادل (هتي حوالو ڏنو ويو آهي His-NT-L6) مضبوط طور تي NT46 مونومر کي مستحڪم ڪري ٿو.ان مفروضي جي بنياد تي ته NT جيل ٺهڻ لاءِ ساخت جي لچڪ جي ضرورت آهي، اسان ڏٺا ته سندس-NT-L6 مستحڪم ميوٽيٽ 37 ° C (Figure 5c، d) تي جيل نه ڪيو.جڏهن ته، سندس-NT-L6 پڻ 60 ° سي تي 60 منٽ لاء انڪيوبيشن تي هڪ جيل ٺاهي (Fig. 5c).
NT جي β-شيٽ جي جوڙجڪ ۾ تبديل ٿيڻ جي صلاحيت ۽ هائيڊروگلز ٺاهڻ جي صلاحيت ڪجهه تي لاڳو ٿئي ٿي پر اسپيڊروئن جي سڀني NT ڊومينز تي نه.NTs مختلف ريشم جي قسمن ۽ مکڻ جي نسلن مان، Trichonephila clavipes (NTFlSp)، انهن جي نسبتا گھٽ ميٿيونائن مواد ۽ اعلي حرارتي استحڪام جي باوجود جيل ٺاهيا آهن (تصوير 5e، f ۽ ضمني جدول 2).ان جي ابتڙ، NT کان ننڍي امپولر پروٽين اسپيڊروئن کان Araneus ventricosus (NTMiSp) گھٽ حرارتي استحڪام ۽ اعلي ميٿيونائن مواد سان گڏ هائڊروجيلز (ضمني جدول 2 ۽ تصوير 5e، f) نه ٺاهيا.بعد ۾ intramolecular disulfide بانڊ 29,47 جي موجودگي سان لاڳاپيل ٿي سگهي ٿو.مسلسل، جڏهن NTMiSp جا ڊسلفائيڊ بانڊ گهٽجي ويا، ته اهو 10 منٽ (Fig. 5e) لاءِ 37 ° C تي انڪيوبيشن کان پوءِ هڪ هائيڊروجيل ٺاهيو.آخر ۾، اهو نوٽ ڪيو وڃي ٿو ته ساخت جي لچڪ هڪ اهم آهي، پر صرف نه، NT کان جيل جي ٺهڻ لاء معيار.هڪ ٻيو عنصر جيڪو لاڳاپيل ٿي سگهي ٿو اهو آهي amyloid fibrils ٺاهڻ جو رجحان، ۽ تجزيي سان زپ ڊيٽابيس ۽ والٽز الورورٿم جيل ٺاهڻ جي صلاحيت ۽ امائلائيڊجنڪ علائقن جي موجودگي جي وچ ۾ لاڳاپو ڏيکاري ٿو، ۽ انهي سان گڏ علائقن جي حد تائين پيش گوئي ڪئي وئي آهي. steric zippers ٺاهڻ لاء.اتي ھڪڙو تعلق ھو (ضمني جدول 2 ۽ ضمني تصوير. 9).
NT جي قابليت فبريل ٺاھڻ ۽ سازگار حالتن ۾ جيل ٺاھڻ جي ڪري اسان کي اھو سمجھڻ تي مجبور ڪيو ويو آھي ته NT فيوزن ٻين پروٽين جي ٽڪرن سان گڏ اڃا تائين فيوزن ڀائيوارن جي مڪمل ڪم سان جيل ٺاھي سگھن ٿا.هن کي جانچڻ لاءِ، اسان متعارف ڪرايو گرين فلوروسنٽ پروٽين (GFP) ۽ purine nucleoside phosphorylase (PNP) ترتيب ڏنل NT جي C-terminus تي.نتيجي ۾ پيدا ٿيندڙ فيوزن پروٽين کي E. coli ۾ تمام اعلي فائنل حاصلات سان ظاهر ڪيو ويو (150 mg/L ۽ 256 mg/L شيڪ فلاسڪ ڪلچر لاءِ سندس-NT-GFP ۽ His-NT-PNP، ترتيب سان)، جيڪو ڏيکاريو ويو آهي ان سان مطابقت رکي ٿو. ٻين پروٽينن لاءِ فيوز ٿيل NT Ref.30. His-NT-GFP (300mg/mL) ۽ His-NT-PNP (100mg/mL) فيوزن پروٽين 2 ڪلاڪ ۽ 6.5 ڪلاڪن کان پوءِ 37°C تي جيل ٺاهيا ۽، خاص طور تي، GFP فريڪشن ۾ ڪا تبديلي نه رهي.جيليشن کان پوءِ مشاهدو ڪيو ويو، جيليشن کان پوءِ 70 سيڪڙو ابتدائي فلوروسينس جي شدت باقي رهي ٿي (تصوير 6a).هن جي-NT-PNP حلن ۽ جيلن ۾ PNP سرگرمي کي ماپڻ لاءِ، اسان کي فيوزن پروٽين کي NT سان ٺهڪائڻو پيو ڇاڪاڻ ته خالص تياري جي اينزيميٽڪ سرگرمي gelling concentrations تي assay جي ڳولا جي حد کان ٻاهر هئي.0.01 mg/mL His-NT-PNP ۽ 100 mg/mL NT جي ميلاپ سان ٺھيل جيل، اڳ ۾ ٺھيل نمونن جي شروعاتي اينزيميٽڪ سرگرمي جو 65٪ برقرار رکيو آھي (تصوير 6b).جيل ماپ دوران برقرار رهي (ضمني تصوير. 10).
هز-NT-GFP (300 mg/mL) جي جلي ٿيڻ کان اڳ ۽ بعد ۾ هڪ تعلقي فلورسنس جي شدت ۽ انورٽيڊ شيشي جنهن ۾ His-NT-GFP هائيڊروجيل (300 mg/mL) نظر اچن ٿا ۽ UV روشني هيٺ.پوائنٽون انفرادي ماپون ڏيکاريندا آھن (n = 3)، نقص بار ڏيکاريندا آھن معياري انحراف.اوسط قدر ڏيکاريل آهي غلطي بار جي مرڪز ۾.b PNP سرگرمي فلوروميٽرڪ تجزيي ذريعي حاصل ڪئي وئي حل ۽ جيل تي مشتمل NT (100 mg/ml) ۽ هڪ مرکب جنهن ۾ 0.01 mg/ml his-NT-PNP ۽ 100 mg/ml نيو تائيوان ڊالر.انسيٽ ڏيکاري ٿو هڪ الٽي شيشي جنهن ۾ هائيڊروجيل شامل آهي جنهن ۾ His-NT-PNP (5 ملي ايم اسڪيل بار) شامل آهن.
هتي، اسان 37 ° C (شڪل 1) تي هڪ پروٽين جي حل کي انڪيوب ڪندي NT ۽ ٻين recombinant spidroin پروٽين مان هائيڊروجيلز جي ٺهڻ جي رپورٽ ڪريون ٿا.اسان ڏيکاريون ٿا ته جيليشن جو تعلق α-helices جي β-layers ۾ تبديل ٿيڻ ۽ amyloid-like fibrils (Figs. 3 ۽ 4) جي ٺهڻ سان آهي.اها ڳولها حيرت انگيز آهي جيئن NTs ڪوئل ٿيل گلوبلر پنج-هيلڪس بنڊل آهن جيڪي انهن جي انتهائي تيز حليليت ۽ ڪنسنٽريشن تي وڌيڪ استحڪام لاءِ سڃاتل آهن > 200 mg/mL 4°C تي ڪيترن ڏينهن تائين 27.ان کان علاوه، NTs آساني سان µM ۾ گھٽ پروٽين جي ڪنسنٽريشن تي گرمي جي خراب ٿيڻ کان پوء ٻيهر ورجائي ٿو.اسان جي نتيجن جي مطابق، فائبرل ٺهڻ جي ضرورت آهي> 10 mg/mL پروٽين جي ڪنسنٽريشن ۽ ٿوري بلند درجه حرارت (تصوير 1).اهو ان خيال سان مطابقت رکي ٿو ته ايميلوڊ فائبرز گلوبل طور تي فولڊ ٿيل پروٽينن مان ٺاهي سگهن ٿا جيڪي جسماني حالتن هيٺ حرارتي وهڪري جي ڪري جزوي طور تي ظاهر ٿيل حالت ۾ آهن 48.پروٽينن جا مثال جيڪي هن تبديليءَ مان گذريا آهن انهن ۾ شامل آهن انسولين 49,50، β2-مائڪروگلوبلين، ٽرانسٿائيريٽين ۽ لائسوزيم 51,52,53.جيتوڻيڪ NT پنهنجي اصلي حالت ۾ هڪ α-helix آهي، تقريبن 65٪ پوليپيپٽائڊ زنجير اسٽريڪ زپ جي ٺهڻ (Fig. 4e) 45 سان مطابقت رکي ٿي.جيئن ته مونومر متحرڪ طور تي موبائيل 46 آهي، اهو انهن امڪاني امائلائيڊجنڪ علائقن کي معتدل بلند درجه حرارت تي بي نقاب ڪري سگهي ٿو ۽ ڪل پروٽين جي اعلي ڪنسنٽريشن تي ايميلائيڊ فائبرل ٺهڻ 54 لاءِ نازڪ ڪنسنٽريشن تائين پهچي سگهي ٿو.هن دليل جي پٺيان، اسان کي اسپيڊروئن ڪنسنٽريشن ۽ جليشن ٽائيم (Fig. 1c) جي وچ ۾ هڪ ناڪاري لاڳاپو مليو، ۽ جيڪڏهن monomeric NT جي ٺهڻ کي يا ته ميوٽيشنز (NT*, His-NT-L6) ذريعي يا لوڻ جي اضافي سان مستحڪم ڪيو وڃي ٿو، ان کي روڪي سگهي ٿو. ٺاھڻ hydrogels (Fig. 5).
اڪثر ڪيسن ۾، امائلوڊ فائبرز حل مان غائب ٿي ويندا آهن، پر ڪجهه حالتن ۾ اهي هائيڊروگلس 55,56,57 ٺاهي سگهن ٿا.هائيڊروجيل ٺهڻ واري فائبرز ۾ عام طور تي هڪ اعليٰ تناسب هوندو آهي ۽ ماليڪيولر اننگلمينٽ جي ذريعي مستحڪم ٽي-dimensional نيٽ ورڪ ٺاهيندا آهن، 55,58 اسان جي نتيجن سان مطابقت رکن ٿا.ويٽرو ۾ هائيڊروجيل ٺهڻ لاءِ، پروٽين اڪثر ڪري مڪمل طور تي يا جزوي طور تي پکڙيل هوندا آهن، مثال طور، نامياتي محلولن جي نمائش، تيز درجه حرارت (70-90°C) ۽/يا گهٽ پي ايڇ (1.5–3.0)59,60,61,62.هتي بيان ڪيل اسپيڊروئن هائيڊروجيلز کي سخت پروسيسنگ جي ضرورت ناهي، ۽ نه ئي انهن کي هائيڊروجن کي مستحڪم ڪرڻ لاءِ ڪراس لنڪنگ ايجنٽ جي ضرورت آهي.
اهو اڳ ۾ ٻڌايو ويو آهي ته اسپائيڊروئن ٻيهر ورجائي ٿو ۽ QDs، جيڪي ريشمي اسپننگ دوران β-شيٽ سوئچنگ مان گذرندا آهن، هائيڊروجن ٺاهيندا آهن.اسان جي نتيجن جي مقابلي ۾، انڪيوبيشن جا وقت ۽/يا انڪيوبيشن جي درجه حرارت خاص طور تي ڊگھي يا وڌيڪ هئي، ترتيب سان، ۽ نتيجي ۾ هائيڊروجيلز اڪثر مبهم هئا (شڪل 7 ۽ ضمني جدول 1) 37، 38، 63، 64، 65، 66، 67، 68. , 69. فاسٽ جيل جي ڀيٽ ۾، NT هائيڊروگلز> 300 mg/mL (30%) ٻين سڀني بيان ڪيل recombinant اسپائڊر سلڪ پروٽين هائيڊروجيلز، انهي سان گڏ قدرتي هائيڊروجيلز جهڙوڪ جيليٽن، الگينيٽ (2٪)، آگر (0.5٪) ) ۽ ڪوليجن.(0.6٪) (شڪل 7 ۽ ضمني جدول 1 ۽ 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
هن مطالعي ۾ هائيڊروجنز جي جيل ٽائيم ۽ لچڪدار ماڊيولس جي مقابلي ۾ ٻين اسپيڊروئن تي ٻڌل هائيڊروجيلز ۽ چونڊيل قدرتي هائيڊروجيلز سان مقابلو ڪيو ويو.حوالو ڏنو ويو آهي جزن جي حالتن جي وضاحت سان.APS امونيم persulfate، ڪمري جي درجه حرارت.ڊيٽا 37، 38، 39، 64، 65، 66، 67، 68، 69، 70، 71، 72، 73، 74.
مکڻ ظاهر ٿيندا آهن ته اسپائيڊروئن کي اسٽوريج دوران گلڻ کان روڪڻ جا طريقا ٺاهيا ويا آهن.ريشم جي غدود ۾ پروٽين جي اعلي ڪنسنٽريشن جي باوجود، ٽرمينل ڊومين سان لاڳاپيل وڏي ورجائي علائقي جو مطلب آهي ته غدود ۾ NT ۽ CT جو ظاهري ڪنسنٽريشن لڳ ڀڳ 10-20 mg/ml جي برابر آهي، هن مطالعي جي حد ۾.ويٽرو مشاهدو هائڊروجل ٺهڻ لاءِ گهربل.ان کان علاوه، نم جي ساڳئي مقدار 16 مستحڪم NT، جيئن ريشم جي غدود ۾ (تصوير 5b).NT جي ٺاھ جوڙ E. coli cytosol ۾ اڀياس ڪئي وئي آھي ۽ ويٽرو ۾ جانچڻ جي ڀيٽ ۾ وڌيڪ مضبوطيءَ سان ڍڪيل ڏٺا ويا آھن، وڌيڪ ظاھر ڪري ٿو ته لوڻ يا ٻيا عنصر ان جي ويوو ۾ جمع ٿيڻ کي روڪيندا آھن.بهرحال، NTs جي قابليت کي β-شيٽ فائبرز ۾ تبديل ڪرڻ جي صلاحيت ٿي سگهي ٿي فلامنٽ ٺهڻ لاء اهم ۽ مستقبل جي مطالعي ۾ تحقيق ٿيڻ گهرجي.
ان کان علاوه NT-amyloid-like fibril ۽ hydrogel ٺاھڻ جي نون پهلوئن کان علاوه ھن مطالعي ۾ مشاهدو ڪيو ويو آھي، اسان اھو پڻ ڏيکاريون ٿا ته ھن رجحان ۾ شايد بايو ٽيڪنالاجي ۽ بايوميڊيڪل ايپليڪيشنون (تصوير 8).تصور جي ثبوت جي طور تي، اسان NT کي GFP يا PNP سان گڏ ڪيو ۽ ڏيکاريو ته فيوزن پروٽين پڻ ھائڊروجلز ٺاھي ٿو جڏھن 37 ° C تي انڪيوب ڪيو وڃي ٿو ۽ GFP ۽ PNP جزا وڏي تعداد ۾ جيليشن کان پوءِ پنھنجي سرگرمي کي برقرار رکندا آھن (شڪل 6).Nucleoside phosphorylases آهن اهم catalysts synthesis of nucleoside analogues75، جيڪو اسان جي دريافت کي بايوفارماسوٽيڪل انڊسٽري لاءِ لاڳاپيل بڻائي ٿو.فيوزن پروٽين کي ظاهر ڪرڻ جو تصور جيڪو سازگار حالتن ۾ شفاف هائيڊروجيلز ٺاهي ٿو، انهن کي اجازت ڏئي ٿو فنڪشنل هائڊروگلز ٺاهڻ جي لاءِ سازگار پراپرٽيز جي وسيع رينج لاءِ جيئن ته اينزائم اموبيلائيزيشن، ڪنٽرولڊ ڊرگ رليز ۽ ٽشو انجنيئرنگ.ان کان علاوه، NT ۽ NT* موثر ايڪسپريشن مارڪر 30 آهن، جنهن جو مطلب آهي ته NT ۽ ان جي مختلف قسمن کي استعمال ڪري سگھجن ٿا اعليٰ ذريعي حل ٿيندڙ فيوزن پروٽين جي پيداوار ۽ بعد ۾ 3D هائيڊروجيلز ۾ متحرڪ ٽارگيٽ پروٽين جي تخليق لاءِ.
NT حل ٿيندڙ، α-helical ۽ مستحڪم آھي گھٽ ڪنسنٽريشن (µM) ۽ 37°C تي.ساڳئي درجه حرارت تي، پر وڌندڙ ڪنسنٽريشن تي (> 10 mg/ml)، NT جيل ٺاهيندا آهن جن ۾ امائلائڊ جهڙوڪ فائبرز شامل آهن.NT فيوزن پروٽين پڻ مڪمل طور تي فنڪشنل فيوزن ٽڪرن سان فائبرلر جيل ٺاهيندا آهن، مختلف پروٽينن کي NT استعمال ڪندي 3D هائيڊروجنز ۾ متحرڪ ٿيڻ جي اجازت ڏين ٿا.هيٺيون: NT (PDB: 4FBS) ۽ فائبر نيٽ ورڪ ۽ لاڳاپيل پروٽين جي جوڙجڪ جا عڪس (فرض ڪيو ويو ۽ نه ٺهيل پيماني تي، GFP PDB: 2B3Q، 10.2210/pdb2B3Q/pdb؛ PNP PDB: 4RJ2، 10.22210/pdbRJ40).
تعميرات (ڏسو ضمني جدول 4 مڪمل فهرست لاءِ امينو اسيد جي ترتيبن سميت) کي ڪلون ڪيو ويو پلازميڊ pT7 ۾ ۽ تبديل ڪيو ويو E. coli BL21 (DE3).E. coli جنهن ۾ انجنيئر ٿيل پلازميڊ شامل هئا، لوريا برٿ ۾ ڪنامائيسن (70 mg/l) جي اضافي ۾ داخل ڪيا ويا ۽ 30 ° C ۽ 250 rpm تي رات جو وڌو.ان کان پوءِ ڪلچر کي 1/100 ايل بي ميڊيم ۾ داخل ڪيو ويو جنهن ۾ ڪناميسين شامل آهي ۽ ڪلچر ڪيو ويو 30°C ۽ 110 rpm تي جيستائين OD600 0.8 تي پهچي ويو.NMR مطالعي لاءِ، بيڪٽيريا M9 گھٽ ۾ گھٽ وچولي ۾ پوکيا ويا جن ۾ 2 g D- گلوڪوز 13C (Aldrich) ۽ 1 g ammonium chloride 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) پروٽين جي ليبلنگ لاءِ آئسوٽوپس سان.گرمي پد کي 20 درجا سينس تائين گھٽ ڪريو ۽ پروٽين جي اظهار کي 0.15 ايم ايم آئيوسوپروپيلٿيوگليڪٽوپيراناسائيڊ (فائنل ڪنسنٽريشن) سان وڌايو.رات جو پروٽين جي اظهار کان پوء، سيلز 7278 × g، 4 ° C تي 20 منٽ لاء حاصل ڪيا ويا.20 ايم ايم ٽريس-ايڇ سي ايل، پي ايڇ 8، ۽ وڌيڪ استعمال ٿيڻ تائين منجمد ٿيل سيل پيليٽس کي بحال ڪيو ويو.30 kPa تي ٿلهي ٿيل سيلن کي سيل ڊسڪٽر (TS سيريز مشين، ڪانسٽنٽ سسٽم لميٽيڊ، انگلينڊ) استعمال ڪيو ويو.پوءِ ليسيٽس کي 25,000 گرام تي 30 منٽن لاءِ 4 ڊگري سينٽي گريڊ تي سينٽرفيوج ڪيو ويو.NTMiSp لاءِ، گولي کي وري 2 ايم يوريا، 20 ايم ايم ٽريس-ايڇ سي ايل، پي ايڇ 8، ۽ 2 منٽ لاءِ سونيڪ ڪيو ويو (2 s آن/آف، 65٪)، پوءِ وري سينٽرفيوج ڪيو ويو 25,000 xg، 4° C. اندر 30 منٽ.سپرنيٽنٽ کي ني-اين ٽي اي ڪالمن تي لوڊ ڪيو ويو، 20 ايم ايم ٽريس-ايڇ سي ايل، 2 ايم ايم اميڊازول، پي ايڇ 8 سان ڌوئي ويو، ۽ آخرڪار پروٽين کي 20 ايم ايم ٽريس-ايچ سي ايل، 200 ايم ايم اميڊازول، پي ايڇ 8 سان ڌوئي ويو. NT2RepCT ۽ پيدا ڪرڻ لاء. NTCT، thrombin digestion هن جي ۽ NT جي وچ ۾ سائيٽ (ThrCleav) متعارف ڪرايو.Thrombin cleavage سائيٽون پڻ موجود آهن His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep پيدا ڪري ٿو)، His-thioredoxin-ThrCleav-NT (NT پيدا ڪري ٿو)، His-thioredoxin-ThrCleav-CT (سي ٽي پيدا ڪري ٿو)، His-Thioredoxin-ThrCleav-NT. .* (پيدا ڪري ٿو NT*)، His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R پيدا ڪري ٿو)، His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp پيدا ڪري ٿو)، ۽ His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (پيدا ڪري ٿو NTA72R).ٺاھڻ کي ٿروبين (1:1000) سان ھضم ڪيو ويو ۽ 20 ايم ايم ٽريس-HCl، pH 8 سان 4 ° C تي رات جو ڊائلائيز ڪيو ويو، 6-8 kDa جي ماليڪيولر وزن جي حد سان گڏ اسپيڪٽرا/پور ڊائليسس جھلي کي استعمال ڪندي.ڊائليسس کان پوء، حل هڪ Ni-NTA ڪالمن تي لوڊ ڪيو ويندو آهي ۽ دلچسپي جي پروٽين تي مشتمل پاڻي گڏ ڪيو ويندو آهي.پروٽين جي مقدار جو اندازو لڳايو ويو UV جذب کي ماپڻ سان 280 nm تي هر پروٽين جي ختم ٿيڻ جي کوٽائي کي استعمال ڪندي، سواء NTF1Sp جي، جيڪو ٺاهيندڙ جي پروٽوڪول جي مطابق برادفورڊ پراڊڪٽ استعمال ڪيو.پاڪائي SDS polyacrylamide (4-20٪) جيل الیکٹروفورسس ۽ Coomassie شاندار نيري داغ جي ذريعي طئي ڪئي وئي هئي.پروٽينن کي سينٽرفيوج فلٽر استعمال ڪندي مرڪوز ڪيو ويو (VivaSpin 20, GE Healthcare) 4000 xg تي 10 kDa ماليڪيولر ويٽ ڪٽ آف سان 20 منٽ چڪر ۾.
پروٽين جي حل کي ٿڪايو ۽ 150 µl کي احتياط سان 1 ml صاف سيپٽم شيشي (8 x 40 mm Thermo Scientific) ۾ وجهي ڇڏيو.نلڪن کي بند ڪيو ويو ۽ پارافيلم سان سيل ڪيو ويو ته جيئن بخار ٿيڻ کان بچڻ لاء.نمونا (n = 3) 37 ° C يا 60 ° C تي پکڙيل هئا ۽ وقتي طور تي جيليشن جو مشاهدو ڪرڻ لاءِ ان کي ڦيرايو ويو.نمونا جيڪي جيل نه هوندا هئا گهٽ ۾ گهٽ هڪ هفتي لاءِ انڪيوبيٽ ڪيا ويا.10 ايم ايم ڊي ٽي ٽي في 10 µM پروٽين سان NTMiSp ڊسلفائيڊ بانڊ کي گھٽايو.قدرتي اسپائڊر ريشمي ڪوٽنگن جي جيليشن جو تجزيو ڪرڻ لاءِ، سويڊن جي پل اسپائڊر کي ڪٽيو ويو، ٻن مکيه امپول ٿيل غدود کي 200 μl 20 mM Tris-HCl بفر pH 8 ۾ رکيو ويو ۽ کوٽ کي غدود کان الڳ ڪرڻ جي اجازت ڏيڻ لاءِ ڪٽيو ويو..غدود جي مواد کي بفر ۾ ورهايو ويندو آهي، خشڪ وزن جي تعين لاءِ 50 µl (60 °C تي کليل شيشي جي انڪيوبيشن ذريعي مسلسل وزن تائين) ۽ 150 µl جِليشن لاءِ 37 °C تي.
ماپڻ وارو جاميٽري/اوزار 20 ملي ميٽر جي مٿاهين قطر ۽ 0.5 ملي ميٽر جي خال سان متوازي پليٽ استعمال ڪندي اسٽينلیس سٹیل مان ٺهيل آهي.نموني کي 25 °C کان 45 °C تائين ۽ واپس 25 °C تائين 1 °C في منٽ جي رفتار سان اسٽينلیس اسٽيل جي هيٺان پيلٽير پليٽ استعمال ڪندي.100 mg/mL ۽ 300-500 mg/mL جي نموني لاءِ 5% ۽ 0.5% جي دٻاءَ تي 0.1 Hz جي فريڪوئنسي تي ۽ مواد جي لڪير واري ويسڪولاسٽڪ واري علائقي ۾ 100 mg/mL ۽ 300-500 mg/mL لاءِ ٿڌ جي ماپ ڪئي وئي.بخارات کي روڪڻ لاءِ حسب ضرورت نمي واري چيمبر استعمال ڪريو.ڊيٽا جو تجزيو ڪيو ويو پرزم 9 استعمال ڪندي.
800 کان 3900 سينٽي ميٽر تائين ڪمري جي حرارت تي انفراريڊ (IR) اسپيڪٽرا گڏ ڪرڻ لاءِ.ATR ڊيوائس، ۽ گڏوگڏ اسپيڪٽروميٽر ذريعي روشني جو رستو، تجربو کان اڳ ۽ دوران خشڪ فلٽر ٿيل هوا سان صاف ڪيو ويو آهي.حل (500 mg/mL اسپيڪٽرا ۾ پاڻي جي جذب جي چوٽي کي گھٽ ڪرڻ لاءِ) ڪرسٽل تي پائپ ڪيا ويا، ۽ جيل (500 mg/mL) ماپ کان اڳ ٺاهيا ويا ۽ پوءِ ڪرسٽل ڏانهن منتقل ڪيا ويا (n = 3).1000 اسڪين 2 سينٽي-1 جي ريزوليوشن سان رڪارڊ ڪيا ويا ۽ 2 جي صفر ڊيوٽي چڪر. ٻيو نڪتل حساب ڪيو ويو OPUS (Bruker) استعمال ڪندي نو پوائنٽن جي هموار رينج استعمال ڪندي.1720 ۽ 1580 cm-1 جي وچ ۾ هڪ ئي انٽيگريشن واري علائقي ۾ اسپيڪٽرا کي عام ڪيو ويو F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software” استعمال ڪندي.ATR-IR اسپيڪٽروڪوپي ۾، هڪ نموني ۾ انفراريڊ بيم جي دخول جي کوٽائي وينمبر تي منحصر آهي، جنهن جي نتيجي ۾ اعلي موجن نمبرن جي ڀيٽ ۾ هيٺين وينمبرز تي مضبوط جذب ٿئي ٿي.انهن اثرات کي درست نه ڪيو ويو آهي اسپيڪٽرا لاءِ تصوير ۾ ڏيکاريل آهي.3 ڇاڪاڻ ته اهي تمام ننڍا آهن (ضمني شڪل 4).هن انگن اکرن لاء درست اسپيڪٽرا Bruker OPUS سافٽ ويئر استعمال ڪندي حساب ڪيو ويو.
اصولي طور تي، پروٽين جي ٺاھ جوڙ جي هڪ جامع مقدار کي امڪاني I چوٽي جي اندر اجزاء جي قابل اعتماد deconvolution کان پوء ممڪن آهي.بهرحال، ڪجهه رڪاوٽون عملي طور تي پيدا ٿين ٿيون.اسپيڪٽرم ۾ شور ظاهر ٿي سگھي ٿو (غلط) چوٽي deconvolution دوران.ان کان علاوه، پاڻي جي موڙيندڙ چوٽي امائيڊ I جي چوٽي جي پوزيشن سان ٺهڪي اچي ٿي ۽ ٿي سگهي ٿو ته ان نموني لاءِ هڪجهڙائي هجي جنهن ۾ وڏي مقدار ۾ پاڻي هجي، جيئن هتي اڀياس ڪيل آبي جيل.تنهن ڪري، اسان مڪمل طور تي امائيڊ I چوٽي کي ختم ڪرڻ جي ڪوشش نه ڪئي، ۽ اسان جي مشاهدي کي صرف ٻين طريقن جهڙوڪ NMR اسپيڪٽروڪوپي جي حمايت ۾ سمجهيو وڃي.
50 mg/ml NT ۽ His-NT2RepCT جا حل رات جو 37 ° C تي گل ڪيا ويا.هائيڊروجيل کي پوءِ 20 ايم ايم ٽريس-ايچ سي ايل (پي ايڇ 8) سان 12.5 ملي گرام / ايم ايل جي ڪنسنٽريشن تائين ملائي، چڱيءَ طرح ڇڪيو ويو ۽ جيل کي ٽوڙڻ لاءِ پائپ ڪيو ويو.اڳيون، هائيڊروجيل کي 10 ڀيرا 20 ايم ايم ٽريس-HCl (pH 8) سان ٺهڪيو ويو، نموني جو 5 μl هڪ ٽامي گرڊ تي لاڳو ڪيو ويو فارموار سان گڏ، ۽ اضافي نموني کي بلوٽنگ پيپر سان هٽايو ويو.نمونا ٻه ڀيرا ڌويا ويا 5 µl MilliQ پاڻي سان ۽ 1٪ يورانيل فارميٽ سان 5 منٽن لاءِ داغ.جاذب پيپر سان اضافي داغ هٽايو، پوءِ ميش کي هوا ۾ سڪي ڇڏيو.100 kV تي هلندڙ FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN استعمال ڪندي انهن گرڊن تي تصويري چڪاس ڪئي وئي.تصويرون x 26,500 ۽ x 43,000 ميگنيفڪيشن تي رڪارڊ ڪيون ويون هڪ Veleta 2k × 2k CCD ڪئميرا (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany).هر نموني لاءِ (n = 1)، 10-15 تصويرون رڪارڊ ڪيون ويون.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) تصوير جي تجزيو ۽ فائبر قطر جي ماپ لاء استعمال ڪيو ويو (n = 100، مختلف فائبر).پرزم 9 استعمال ڪيو ويو غير جوڙيل ٽي ٽيسٽ انجام ڏيڻ لاءِ (ٻه دم وارو).مطلب سندس-NT2RepCT ۽ NT fibrils هئا 11.43 (SD 2.035) ۽ 7.67 (SD 1.389) nm، ترتيب سان.اعتماد جو وقفو (95٪) -4.246 کان -3.275 آهي.آزادي جا درجا = 198، p <0.0001.
80 µl مائع جا نمونا جن ۾ 10 µM thioflavin T (ThT) شامل آهن ٽنهي (n = 3) ۾ ماپيا ويا جامد حالتن هيٺ ڪارننگ 96-well ڪارو هيٺيون صاف هيٺيون پليٽس استعمال ڪندي (ڪارننگ گلاس 3881، USA).440 nm excitation فلٽر ۽ 480 nm اخراج فلٽر (FLUOSstar Galaxy from BMG Labtech, Offenburg, Germany) استعمال ڪندي فلورسنس فرق رڪارڊ ڪيو ويو.ThT سگنل نه ته سير ٿيل هو ۽ نه ئي ختم ٿي ويو، جيئن ته سگنل جي شدت کي تبديل ڪرڻ کان سواءِ ThT جي مختلف ڪنسنٽريشن سان تجربا ڪيا ويا.هيز جي ماپ لاءِ 360 nm تي ريڪارڊ جذب.ٻج جي تجربن لاءِ، 100 mg/mL gels 37° C. تي ٺاهيا ويا، بحال ڪيا ويا، ۽ 5%، 10%، ۽ 20% جي داغ جي نسبت سان ٻج جي لاءِ استعمال ڪيا ويا.ڊيٽا جو تجزيو ڪيو ويو پرزم 9 استعمال ڪندي.
His-NT2RepCT ۽ NT>100 mg/mL جي اسٽاڪ کي برف تي اڇليو ۽ 0.22 µm فلٽر ذريعي فلٽر ڪريو.Nanodrop استعمال ڪندي 280 nm تي جذب کي ماپڻ جي حساب سان حساب ڪيو ويو.96-ڪلاڪ نان بائنڊنگ پليٽ (ڪارننگ) جي کوهن ۾ صاف هيٺان، نمونن کي 20 mg/ml ۾ 20 mM Tris-HCl pH 8 ۾ ملايو ويو ۽ 5 μM ThT (فائنل ڪنسنٽريشن) سان ملايو ويو، ڪل نموني ڪنسنٽريشن 50 μl حجم.نمونا هر 10 منٽن تي 37 ° C تي CellObserver (Zeiss) مائڪرو اسڪوپ تي منتقل ٿيل لائٽ چينل ۽ FITC جوش ۽ THT اميجنگ لاءِ ايميشن فلٽر سيٽ سان گڏ ڪيا ويا.هڪ 20x/0.4 لينس تصويرن لاءِ استعمال ٿيندو آهي.Zen Blue (Zeiss) ۽ ImageJ (https://imagej.nih.gov/) تصويري تجزيي لاءِ استعمال ڪيا ويا.جيل پڻ NT ۽ His-NT2RepCT حلن مان 50 mg/mL جي ڪنسنٽريشن تي تيار ڪيا ويا جن ۾ 20 mM Tris pH 8 ۽ 5 µM ThT ۽ 90 منٽ لاءِ 37 ° C تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو.جيل جا ٽڪرا هڪ نئين کوهه ۾ منتقل ڪيا ويا جن ۾ 20 ايم ايم ٽريس، پي ايڇ 8، ۽ 5 μM ThT هڪ غير پابند ڪاري 96 چڱي طرح صاف هيٺان پليٽ ۾.20x/0.4 ميگنيفڪيشن تي گرين فلورسنس ۽ روشن فيلڊ تصويرون حاصل ڪريو.ImageJ تصوير جي تجزيو لاء استعمال ڪيو ويو.
حل NMR اسپيڪٽرا حاصل ڪيا ويا 310 K تي 600 MHz Bruker Avance Neo spectrometer تي هڪ QCI Quadrupole Resonance Pulse Gradient Field Cryoprobe (HFCN) سان ليس.NMR نموني تي مشتمل 10 mg/mL هڪجهڙائي واري پروٽين تي مشتمل آهي 13C، 15N سان ليبل ٿيل، 20 ايم ايم ٽريس-HCl (pH 8)، 0.02٪ (w/v) NaN3، 5٪ DO (v/v)، (n = 1) .NT2RepCT جي ڪيميائي شفٽون پي ايڇ 6.7 تي 15N-HSQC جي 2D اسپيڪٽرم ۾ چوٽي 23 کي تفويض ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيون ويون.
13C جو جادو زاويه گھمڻ وارو سولڊ NMR (MAS) اسپيڪٽرا، 15N-ليبل ٿيل هائيڊروجيلز هڪ Bruker Avance III HD اسپيڪٽروميٽر تي 800 MHz تي 3.2 mm 13C/15N{1H} اليڪٽران بيس پروب سان ليس هوندا هئا.نموني جي درجه حرارت کي 277 KHz تي متغير درجه حرارت گيس اسٽريم استعمال ڪندي ڪنٽرول ڪيو ويو. ٻه طرفي ڊيپول روٽيشنل گونج (DARR) 76 ۽ ريڊيو فريڪوئنسي ٻيهر ڪنيڪشن (RFDR) 77 اسپيڪٽرا حاصل ڪيا ويا 12.5 kHz ۽ 20 kHz جي MAS فريڪوئنسي تي.1H کان 13C تائين ڪراس پولرائيزيشن (CP) 1H تي 60.0 کان 48.0 kHz تائين 1H تي، 61.3/71.6 kHz 13C تي (12.5/20 kHz MAS تي) ۽ رابطي جو وقت 0.5-1 ms تائين هڪ لينر ريمپ استعمال ڪندي ڪيو ويو.Spinal6478 decoupling 73.5 kHz تي ڊيٽا گڏ ڪرڻ دوران استعمال ڪيو ويو.حاصل ڪرڻ جو وقت 10 مليسيڪنڊ هو ۽ چڪر جي دير هئي 2.5 سيڪنڊ.واحد ڳنڍيل Cα / Cβ لاڳاپن جو مشاهدو ڪيو ويو RFDR اسپيڪٽرا ۾ مخصوص رهائش واري قسم جي ڪيميائي شفٽ ۽ DARR اسپيڪٽرا ۾ ضرب سان ڳنڍيل رابطي جي بنياد تي.
Zipper79 ڊيٽابيس (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT، NTFlSp، ۽ NTMiSp لاءِ فلٽر رجحانات ۽ Rosetta توانائي جو جائزو وٺڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو.Zipper ڊيٽابيس Rosetta Energy80 کي گڏ ڪري ٿو، جيڪو پروٽين جي جوڙجڪ کي ماڊل ۽ تجزيو ڪرڻ لاء ڪيترن ئي مفت توانائي جي ڪمن کي گڏ ڪري ٿو.هڪ توانائي جي سطح -23 kcal/mol يا ان کان گھٽ فيبريليٽ جي اعلي رجحان کي اشارو ڪري ٿي.هيٺين توانائي جو مطلب آهي زپ جي جوڙجڪ ۾ ٻن β-strands جي وڌيڪ استحڪام.ان کان علاوه، والٽز الگورتھم استعمال ڪيو ويو NT، NTFlSp ۽ NTMiSp Ref ۾ amyloidogenic علائقن جي اڳڪٿي ڪرڻ لاء.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT پروٽين جو حل 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) بفر سان pH 5.5 ۽ 6.0 تي ملايو ويو ته جيئن pH کي pH 6 ۽ 7 تائين گھٽايو وڃي.آخري پروٽين جي ڪنسنٽريشن 100 mg/ml هئي.
ماپون J-1500 CD اسپيڪٽروميٽر (JASCO، USA) تي 300 μL ڪيويٽ استعمال ڪندي 0.1 سينٽي ميٽر جي آپٽيڪل رستي سان ڪيون ويون.20 ايم ايم فاسفٽ بفر (پي ايڇ 8) ۾ پروٽين کي 10 μM (n = 1) تائين ملائي وئي.لوڻ جي موجودگي ۾ پروٽين جي استحڪام جو تجزيو ڪرڻ لاء، 20 ايم ايم فاسفيٽ بفر (پي ايڇ 8) ۾ 154 ايم ايم NaF يا NaCl تي مشتمل ساڳئي ڪنسنٽريشن (n = 1) تي پروٽين جو تجزيو ڪيو ويو.درجه حرارت اسڪين 222 nm تي 25 ° C کان 95 ° C تائين 1 ° C / منٽ جي گرمي جي شرح سان رڪارڊ ڪيا ويا.اصلي طور تي فولڊ ٿيل پروٽين جو تناسب فارمولا استعمال ڪندي حساب ڪيو ويو (KDmeasure - KDfinal) / (KDstart - KDfinal).ان کان علاوه، هر نموني لاء پنج اسپيڪٽرا رڪارڊ ڪيا ويا 260 nm کان 190 nm تائين 25 ° C تي ۽ گرم ڪرڻ کان پوء 95 ° C تائين.پنج اسپيڪٽرا کي سراسري، هموار ۽ داغ جي بيضوي ۾ تبديل ڪيو ويو.ڊيٽا جو تجزيو ڪيو ويو پرزم 9 استعمال ڪندي.
His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) جي فلورسنس جي شدت کي 96-ڪلين ڪارننگ پليٽن ۾ ٽرپليڪٽ (n = 3) ۾ ماپيو ويو هڪ ڪارو شفاف هيٺان سان (ڪارننگ گلاس 3881، USA) جامد حالتن هيٺ.395 nm جي excitation wavelength سان fluorescence-based پليٽ ريڊر سان نمونن کي ماپ ڪريو ۽ اخراج کي 509 nm تي جيليشن کان اڳ ۽ 2 ڪلاڪ بعد 37°C تي رڪارڊ ڪريو.ڊيٽا جو تجزيو ڪيو ويو پرزم 9 سان.
Purine nucleoside phosphorylase سرگرمي assay kit (fluorometric طريقو، Sigma Aldrich) ٺاهيندڙن جي هدايتن جي مطابق استعمال ڪيو ويو.جيل ۽ حلن ۾ سرگرمي کي ماپڻ لاءِ His-NT-PNP تي مشتمل 10 ng His-NT-PNP کي 100 mg/mL NT سان ملايو 2 µL جي ڪل مقدار ۾ ڇاڪاڻ ته جيل هڪ سگنل ڏنو آهي سيٽ جي چڪاس جي وقفي کان مٿي.سندس-NT-PNP کان سواء جيل ۽ حل لاء ڪنٽرول شامل هئا.ماپ ٻه ڀيرا ڪيا ويا (n = 2).سرگرمي جي ماپ کان پوء، رد عمل جو مرکب هٽايو ويو ۽ جيل کي پڪڙيو ويو ته ماپ دوران جيل برقرار رهي.ڊيٽا جو تجزيو ڪيو ويو پرزم 9 استعمال ڪندي.
مطالعي جي ڊيزائن تي وڌيڪ معلومات لاء، هن مضمون سان ڳنڍيل فطرت جي مطالعي جو خلاصو ڏسو.
انگ اکر 1 ۽ 2 شروعاتي ڊيٽا پيش ڪن ٿا.1c، 2a-c، 3a، b، e-g، 4، 5b، d، f، ۽ 6، اضافي انجير.3، اضافي انجير.5a، ڊي، اضافي انجير.6 ۽ اضافي انجير.8. هن مطالعي مان ڊيٽا جي ڊيٽا زينوڊو ڊيٽابيس ۾ ميزباني ڪئي وئي آهي https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.هن مطالعي ۾ حاصل ڪيل NMR ڊيٽا داخلا ID bmrbig36 تحت BMRBig مخزن تي پوسٽ ڪئي وئي.GFP ۽ PNP جي جوڙجڪ PDB کان ورتو ويو (GFP 2B3Q، PNP 4RJ2).
رائزنگ، اي ۽ جوهانسن، جي. اسپننگ مصنوعي اسپائڊر سلڪ.قومي ڪيميائي.حياتيات.11، 309-315 (2015).
باب، پي ايل وغيره.Nephila clavipes جينوم اسپائڊر ريشم جين جي تنوع ۽ انهن جي پيچيده اظهار کي نمايان ڪري ٿو.نيشنل جينٽ.49، 895-903 (2017).