347 12.7*1.24mm اسٽينلیس سٹیل ڪوائل ٿيل ٽيوبنگ، هم وقت ساز اليڪٽرروسٽٽڪ ڪنڊينسيشن جو ماليڪيولر ميڪنزم ۽ α-synuclein ۽ تائو جي گڏ ٿيڻ

Nature.com گهمڻ لاءِ توهان جي مهرباني.توھان استعمال ڪري رھيا آھيو برائوزر ورزن محدود CSS سپورٽ سان.بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي بند ڪريو).اضافي طور تي، جاري مدد کي يقيني بڻائڻ لاء، اسان سائيٽ کي بغير اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ ڏيکاريون ٿا.
سلائڊر ڏيکاريندڙ ٽي مضمون في سلائڊ.سلائڊ ذريعي منتقل ڪرڻ لاء پوئتي ۽ ايندڙ بٽڻ استعمال ڪريو، يا هر سلائڊ ذريعي منتقل ڪرڻ لاء آخر ۾ سلائڊ ڪنٽرولر بٽڻ استعمال ڪريو.

347 اسٽينلیس سٹیل پائپ جي وضاحت

347 12.7 * 1.24mm اسٽينلیس سٹیل ڪوئلڊ ٽيوبنگ

قطر کان ٻاهر: 6.00 mm OD تائين 914.4 mm OD تائين، سائيز 24 ”NB تائين موجود Ex-Stock، OD Size Steel Tubes موجود Ex-Stock

SS 347 پائپ ٿولهه جي حد: 0.3mm - 50mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S، SCH10S، SCH40S، SCH80S، SCH160S، وغيره

قسم: ايس ايس 347 سيمينٽ پائپس |SS 347 ERW پائپس |ايس ايس 347 ويلڊڊ پائپس |SS 347 ٺهيل پائپس |SS 347 CDW ٽيوب، LSAW پائپس / سيم ويلڊڊ / ريڊرن

فارم: SS 347 گول پائپس/ ٽيوب، SS 347 اسڪوائر پائپس/ ٽيوب، SS 347 مستطيل پائپ/ ٽيوب، SS 347 ڪوئل ٿيل ٽيوب، SS 347 “U” شڪل، SS 347 Pan Cake Coils، SS 347 Hydra

ڊگھائي: سنگل بي ترتيب، ٻيڻو بي ترتيب ۽ گھربل ڊگھائي آخر: پڌرو پڄاڻي، بيولڊ آخر، ٽريڊ ٿيل

آخر تحفظ: پلاسٽڪ ڪيپس |ٻاهران ختم: 2B، No.4، No.1، No.8 آئيني ختم اسٽينلیس اسٽيل پائپ لاءِ، ڪسٽمر جي گهرج مطابق ختم

ترسيل حالت: اينيل ٿيل ۽ اچار، پالش، روشن اينيلڊ، ٿڌو ٺهيل

انسپيڪشن، ٽيسٽ رپورٽون: مل ٽيسٽ سرٽيفڪيٽ، EN 10204 3.1، ڪيميائي رپورٽون، ميڪيڪل رپورٽون، PMI ٽيسٽ رپورٽون، بصري انسپيڪشن رپورٽون، ٽئين پارٽي انسپيڪشن رپورٽون، NABL منظور ٿيل ليب رپورٽون، تباهي واري ٽيسٽ رپورٽ، غير تباهي واري ٽيسٽ رپورٽون

پيڪنگ: ڪاٺ جي دٻي ۾ ڀريل، پلاسٽڪ جي ٿلهي، اسٽيل پٽي بنڊل، يا گراهڪن جي درخواستن جي مطابق

خاص: مٿي کان سواء ٻيون سائيز ۽ وضاحتون درخواست تي ٺاهي سگھجن ٿيون

SS 347 پائپ سائيز جي حد: 1/2 انچ NB، OD کان 24 انچ

ASTM A312 347: بيحد ۽ سڌي-سيام ويلڊڊ ايسٽينيٽڪ پائپ جو مقصد اعلي درجه حرارت ۽ عام corrosive خدمت لاءِ.ويلڊنگ دوران فلر ڌاتو جي اجازت ناهي.

ASTM A358 347: corrosive ۽ / يا اعلي درجه حرارت جي خدمت لاء اليڪٽرڪ فيوزن ويلڊڊ آسٽنيٽڪ پائپ.عام طور تي صرف 8 انچ تائين پائپ هن وضاحت لاء پيدا ڪئي وئي آهي.ويلڊنگ دوران فلر ڌاتو کي شامل ڪرڻ جي اجازت آهي.

ASTM A790 347: بيحد ۽ سڌي-سيام ويلڊڊ فيريٽڪ/آسٽنيٽڪ (ڊپليڪس) پائپ جو مقصد عام corrosive خدمت لاءِ، خاص زور سان corrosion cracking جي دٻاءَ جي مزاحمت تي.

ASTM A409 347: سڌي-سيام يا سرپل-سيام اليڪٽرڪ فيوزن ويلڊ ٿيل وڏي قطر جي آسٽنيٽڪ لائيٽ-وال پائپ 14” کان 30“ جي ماپن ۾ ديوارن سان Sch5S ۽ Sch 10S corrosive ۽/يا اعليٰ لاءِ

ASTM A376 347: تيز درجه حرارت جي ايپليڪيشنن لاءِ بيحد آسٽينيٽڪ پائپ.

ASTM A813 347: سنگل سيم، سنگل يا ڊبل ويلڊڊ ايسٽينيٽڪ پائپ اعليٰ درجه حرارت ۽ عام corrosive ايپليڪيشنن لاءِ.

ASTM A814 347: ٿڌي ڪم ٿيل ويلڊڊ ايسٽينيٽڪ پائپ اعليٰ درجه حرارت ۽ عام corrosive خدمت لاءِ.

347H اسٽينلیس سٹیل پائپس ڪيميائي ساخت

اسٽينلیس سٹیل 347H پائپ مشيني خاصيتون

اسٽينلیس سٹیل 347H پائپس جسماني ملڪيت

347H اسٽينلیس سٹیل پائپ لاء برابر گريڊ

Amyloid alpha-synuclein (αS) aggregation پارڪنسن جي بيماري ۽ ٻين synucleinopathies جو هڪ نشان آهي.تازو، ٽائو پروٽين عام طور تي الزائمر جي بيماري سان جڙيل آهي αS پيٽولوجي سان جڙيل آهي ۽ αS سان ڀرپور شموليت ۾ گڏيل طور تي جڙيل آهي، جيتوڻيڪ ٻن پروٽينن جي گڏ ٿيڻ جو ماليڪيولر ميڪانيزم واضح ناهي.اسان هتي رپورٽ ڪريون ٿا ته αS مرحلو اليڪٽرروسٽٽڪ ڪمپليڪس ڪنڊينسيشن ذريعي مائع ڪنڊينس ۾ الڳ ٿئي ٿو مثبت طور تي چارج ٿيل پوليپيپٽائڊس جهڙوڪ ٽائو.پوليڪيشنز لاءِ αS جي لاڳاپي ۽ ڪوئگوليشن نيٽ ورڪ جي ويلنس جي گھٽتائي جي شرح تي منحصر ڪري، ڪلٽ تيز رفتار جيليشن يا گڏ ٿيڻ کان پوءِ سست ايميلائڊ ايگريگريشن کان گذرن ٿا.ترقي يافته بايو فزيڪل ٽيڪنالاجي جي هڪ سوٽ کي گڏ ڪرڻ سان، اسان مائع-مائع αS/Tau مرحلي جي علحدگيءَ کي نمايان ڪرڻ جي قابل ٿي ويا هئاسين ۽ انهن اهم عنصرن کي سڃاڻڻ جي قابل ٿي ويا هئا، جيڪي هڪ مائع پروٽين جي ڪنڊينسيٽ ۾ ٻنهي پروٽينن تي مشتمل هيٽروجنيئس مجموعن جي ٺهڻ جو سبب بڻجن ٿا.
جھلي جي حصن کان علاوه، سيلز ۾ مقامي علحدگي پڻ حاصل ڪري سگھجي ٿي پروٽين سان ڀريل، مائع جھڙي گھڻ جسمن جي ٺاھڻ جي ذريعي، جنھن کي بايوموليڪولر ڪنڊينسيٽس يا بوندن سڏيو ويندو آھي، ھڪڙي پروسيس ذريعي، جيڪو مائع-مائع مرحلو علحدگي (LLPS) جي نالي سان سڃاتو وڃي ٿو.اهي قطرا گھڻائي وقتي رابطي ذريعي ٺاهيا ويندا آهن، عام طور تي پروٽين يا پروٽين ۽ آر اين اي جي وچ ۾، ۽ تقريبن سڀني جاندار سسٽم ۾ مختلف ڪمن جي خدمت ڪن ٿا.LLP-قابل پروٽين جو هڪ وڏو تعداد گهٽ پيچيدگي جي ترتيبن کي ظاهر ڪري ٿو جيڪي فطرت ۾ انتهائي خراب آهن ۽ بايوموليڪولر ڪنڊينسيٽس 3,4,5 جي ٺهڻ ۾.ڪيترين ئي تجرباتي مطالعي مان معلوم ٿيو آهي ته پروٽينن جي لچڪدار، اڪثر بي ترتيب، ۽ گھڻائي واري نوعيت کي ٺاهيندا آهن جيڪي اهي مائع-جهڙا ڪنڊينسيٽس ٺاهيندا آهن، جيتوڻيڪ ٿورڙي ڄاڻ آهي ته مخصوص ماليڪيولر ڊيٽرمننٽ جيڪي انهن ڪنڊينيٽس جي واڌ ۽ پختگي کي ڪنٽرول ڪن ٿا. رياست..
نئين ڊيٽا ان مفروضي جي حمايت ڪري ٿي ته غير معمولي پروٽين تي هلندڙ LLPS ۽ بوندن جي مضبوط ساختن ۾ تبديلي شايد لاڳاپيل سيلولر رستا هجن جيڪي ناقابل حل زهر جي مجموعي جي ٺهڻ جي ڪري ٿي جيڪي اڪثر ڪري degenerative بيمارين جا نشان آهن.ڪيتريون ئي ايل ايل پي ايس سان لاڳاپيل اندروني طور تي خراب ٿيل پروٽين (IDPs)، اڪثر ڪري تمام گهڻو چارج ٿيل ۽ لچڪدار، ڊگهي عرصي کان نيوروڊجنريشن سان لاڳاپيل آهن ايميلوڊ مجموعي جي عمل ذريعي.خاص طور تي، بايوموليڪيولر IDP ڪنڊينيٽس جهڙوڪ FUS7 يا TDP-438 يا وڏي گھٽ پيچيدگي واري ڊومينز سان پروٽين جهڙوڪ hnRNPA19 کي ڏيکاريو ويو آهي جيل جھڙي يا اڃا به مضبوط شڪل ۾ هڪ پروسيس ذريعي جنهن کي فلائيڊائزيشن سڏيو ويندو آهي.مرڪبسالڊ فيز ٽرانسشن (LSPT) کي وقت جي ڪم جي طور تي يا ڪجهه پوسٽ-ترجمي واري تبديلين جي جواب ۾ يا pathologically اهم ميوٽيشنز 1,7.
Vivo ۾ LLPS سان لاڳاپيل هڪ ٻيو IDP Tau آهي، هڪ مائڪروٽيوبول سان لاڳاپيل خرابي وارو پروٽين جنهن جي ايميلائڊ مجموعي کي الزائمر جي بيماري 10 ۾ شامل ڪيو ويو آهي پر تازو پارڪنسن جي بيماري (PD) ۽ ٻين synaptic ائٽمي پروٽينپيٿين 11، 12، 13 سان لاڳاپيل آهن.Tau کي ظاھر ڪيو ويو آھي spontaneously حل/cytoplasm کان الڳ ٿيڻ سبب سازگار electrostatic interactions14، جنھن جي نتيجي ۾ tau-enriched droplets ٺھيل آھن جن کي electrostatic coacervates طور سڃاتو وڃي ٿو.اهو پڻ ڏٺو ويو آهي ته هن قسم جي غير مخصوص تعامل فطرت ۾ ڪيترن ئي بايوموليڪيولر ڪنڊينسيٽس جي پويان محرڪ قوت آهي15.ٽائو پروٽين جي صورت ۾، اليڪٽررو اسٽيڪ ايگريگريشن سادو ايگريگريشن ذريعي ٺهي سگهي ٿو، جنهن ۾ پروٽين جا مخالف چارج ٿيل علائقا ڪليويج جي عمل کي شروع ڪن ٿا، يا ناڪاري چارج ٿيل پوليمر جهڙوڪ آر اين اي سان رابطي ذريعي پيچيده مجموعي ذريعي.
تازي طور تي، α-synuclein (αS)، هڪ ايميلوڊ IDP PD ۽ ٻين neurodegenerative بيمارين ۾ جڙيل آهي، مجموعي طور تي synucleinopathy17,18 طور سڃاتو وڃي ٿو، سيلولر ۽ جانورن جي ماڊلز ۾ 19,20 مرڪوز پروٽين جي ڪنڊينٽس ۾ سيال جهڙو رويي سان ظاهر ڪيو ويو آهي.ويٽرو مطالعي ۾ ڏيکاريو ويو آهي ته αS عام طور تي هائيڊروفوبڪ رابطي جي ذريعي سادي مجموعي ذريعي LLPS کان گذري ٿو، جيتوڻيڪ اهو عمل غير معمولي طور تي اعلي پروٽين جي ڪنسنٽريشن ۽ غير معمولي طور تي ڊگهو انڪوبيشن وقت جي ضرورت آهي 19,21.ڇا vivo ۾ مشاهدو ڪيل αS تي مشتمل ڪنڊينيٽس هن يا ٻين LLPS پروسيس ذريعي ٺاهيا ويا آهن هڪ اهم حل ٿيل مسئلو رهي ٿو.اهڙي طرح، جيتوڻيڪ αS amyloid aggregation PD ۽ ٻين synucleinopathies ۾ نيورسن ۾ مشاهدو ڪيو ويو آهي، صحيح ميڪانيزم جنهن جي ذريعي αS انٽرا سيلولر امائلائڊ ايگريگريشن مان گذري ٿو، اهو واضح ناهي، ڇاڪاڻ ته هن پروٽين جي اوور ايڪسپريشن پاڻ طرفان هن عمل کي شروع ڪرڻ لاء ظاهر نٿو ٿئي.اضافي سيلولر نقصان اڪثر گھربل آهي، اهو مشورو ڏئي ٿو ته ڪجهه سيلولر جڳهن يا مائڪرو ماحوليات جي ضرورت هوندي آهي intracellular αS amyloid اسيمبلين جي بحالي لاء.ھڪڙو سيلولر ماحول جيڪو خاص طور تي گڏ ٿيڻ جو امڪان آھي اھو ٿي سگھي ٿو پروٽين جي ڪنڊينسيٽس 23 جو اندروني حصو.
دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، αS ۽ tau کي مليا آهن انهن ۾ شامل ٿيندڙ خاصيتن جي بيماريءَ ۾ انسانن ۾ پارڪنسن جي بيماري ۽ ٻين synucleinopathies 24,25 ۽ تجربن ٻڌايو آهي ته ٻن پروٽينن جي وچ ۾ هڪ synergistic pathological لاڳاپو 26,27 جو مجموعو αS ۽ αS جي وچ ۾ امڪاني تعلق آهي. neurodegenerative بيمارين ۾ tau.بيماري.αS ۽ tau مليا ويا آهن هڪ ٻئي جي مجموعن کي فروغ ڏيڻ ۽ فروغ ڏيڻ لاءِ ويٽرو ۽ vivo 28,29 ۾ ۽ هيٽروجنيئس ايگريگيٽس انهن ٻن پروٽينن مان ٺهيل مريضن جي دماغن ۾ ڏٺو ويو آهي synucleinopathies 30 سان.بهرحال، αS ۽ tau جي وچ ۾ رابطي جي ماليڪيولر بنياد ۽ ان جي گڏيل مجموعي جي ميکانيزم بابت ٿورڙي ڄاڻ آهي.αS کي αS جي انتهائي منفي طور تي چارج ٿيل سي-ٽرمينل علائقي ۽ تاؤ جي مرڪزي پرولين-امير علائقي جي وچ ۾ هڪ برقياتي ڪشش جي ذريعي ٽاؤ سان رابطو ڪرڻ جي خبر ڏني وئي آهي، جيڪو پڻ مثبت طور تي چارج ٿيل ريزيديو ۾ پڻ بهتر آهي.
هن مطالعي ۾، اسان ڏيکاريون ٿا ته αS حقيقت ۾ ٽائو پروٽين جي موجودگي ۾ electrostatic پيچيده ڪنڊينسيشن ذريعي قطرن ۾ ورهائي سگهي ٿو، ان جي ابتڙ ٻين مثبت چارج ٿيل پوليپيپٽائڊس جهڙوڪ پولي-L-lysine (pLK)، ۽ هن عمل ۾.αS ڊراپليٽ نيٽ ورڪ لاءِ اسڪوفڊ ماليڪيول طور ڪم ڪري ٿو.اسان electrostatic αS coacervates جي پختگي جي عمل ۾ قابل ذڪر فرق جي نشاندهي ڪئي آهي، جيڪي coacervate نيٽ ورڪ ۾ شامل پروٽينن جي رابطي جي ويجهڙائي ۽ طاقت ۾ اختلافن سان لاڳاپيل آهن.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، اسان ڏٺو ته αS ۽ tau amyloid پروٽين جي گڏيل مجموعن ۾ ڊگھي رهندڙ مائع ڪوسرويٽس ۾ ۽ ڪجهه اهم عنصرن جي نشاندهي ڪئي آهي جيڪي انهن ٻن پروٽينن جي گڏيل مجموعن کي ڏسندا آهن.هتي اسان تفصيل سان هن عمل کي بيان ڪريون ٿا، جيڪو هڪ ممڪن ماليڪيولر ميکانيزم آهي جيڪو بيماري جي مخصوص شموليت ۾ ٻن پروٽينن جي گڏيل ڪرڻ جي تحت آهي.
αS وٽ غير جانبدار pH (Fig. 1a) تي هڪ انتهائي anionic C-ٽرمينل دم آهي، ۽ اسان اهو سمجهيو ته اهو LLPS ذريعي گذري سگهي ٿو اليڪٽرروسٽٽڪ ڪمپليڪس جي ڪنڊينسيشن ذريعي پوليڪيشنڪ ڊسڊڊڊ پوليپيپٽائڊ انو.اسان هڪ 100-residue poly-L-lysine (pLK) استعمال ڪيو شروعاتي ماڊل ماليڪيول جي ڪري ان جي مثبت طور تي چارج ٿيل ۽ خراب ٿيل پوليميرڪ فطرت جي ڪري غير جانبدار pH 32 تي. پهرين، اسان تصديق ڪئي ته pLK حل NMR اسپيڪٽروسکوپي ذريعي αS جي Ct ڊومين سان رابطو ڪري ٿو. (شڪل 1b) 13C/15N-ليبل ٿيل αS استعمال ڪندي αS:pLK molar ratios وڌائڻ جي موجودگي ۾.αS جي Ct-domain سان pLK جو تعامل پاڻ کي ڪيميائي شفٽ جي خرابين ۾ ظاهر ڪري ٿو ۽ پروٽين جي هن علائقي ۾ چوٽي جي شدت ۾ گهٽتائي.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، جڏهن اسان αS کي ملايو pLK سان تقريبن αS ڪنسنٽريشن تي.5–25 µM polyethylene glycol جي موجودگيءَ ۾ (5–15% PEG-8) (عام LLPS بفر: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) اسان فوري طور تي پروٽين جي ٺهڻ جي وسيع ميدان مان گذرياسين. .fluorescence (WF) ۽ روشن-فيلڊ (BF) مائڪرو اسڪوپي (Fig. 1c) استعمال ڪندي بوندن کي ڏٺو ويو.1-5 µm بوندن تي مشتمل آهي مرڪوز αS (شامل ڪيو ويو 1 µM AlexaFluor488-ليبل ٿيل αS, AF488-αS)، انهن جي اليڪٽرروسٽيٽڪ ملڪيت حاصل ڪري سگهجي ٿي انهن جي مزاحمت کان وٺي 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) ۽ ان جي حساسيت NaCl ڪنسنٽريشن ۾ اضافو (Fig. 1c).αS/pLK electrostatic ڪمپليڪس جي coacervates جي fluid- جهڙو طبيعت مليس سيڪنڊن (Fig. 1d) اندر فيوز ڪرڻ جي انهن جي صلاحيت مان ظاهر ٿئي ٿو.turbidimetry استعمال ڪندي، اسان انهن حالتن هيٺ بوندن جي ٺهڻ جي مقدار جي تصديق ڪئي، ان جي استحڪام سان لاڳاپيل مکيه رابطي جي اليڪٽررو اسٽيڪ فطرت جي تصديق ڪئي (Fig. 1e)، ۽ LLPS جي عمل تي مختلف پوليمر تناسب جي اثر جو جائزو ورتو (تصوير 1f).جيتوڻيڪ بوندن جي ٺهڻ کي پوليمر تناسب جي وسيع رينج تي مشاهدو ڪيو ويو آهي، اهو عمل تمام سازگار آهي جڏهن pLK αS کان وڌيڪ آهي.LLPs کي ڪيميائي طور تي مختلف ڊسپليسنگ ايجنٽ dextran-70 (70 kDa) استعمال ڪندي يا مختلف نمونن جي فارميٽ کي استعمال ڪندي ڏٺو ويو آهي، جنهن ۾ گلاس سلائيڊ ڊراپس، مختلف مواد جا مائڪرو پليٽ ويلز، ايپينڊورف يا کوارٽز ڪيپليئرز شامل آهن.
هن مطالعي ۾ استعمال ٿيل WT-αS ۽ ΔCt-αS مختلف قسمن ۾ مختلف پروٽين جي علائقن جي اسڪيمياتي نمائندگي.amphipathic N-terminal domain، the hydrophobic amyloid-forming (NAC) علائقي، ۽ منفي طور تي چارج ٿيل سي-ٽرمينل ڊومين کي ترتيب سان نيري، نارنگي ۽ ڳاڙهي رنگن ۾ ڏيکاريو ويو آھي.Net Charge per Residual (NCPR) WT-αS جو نقشو ڏيکاريو ويو آھي.macromolecular clumps جي غير موجودگي ۾ αS/pLK رابطي جي NMR تجزيو.جيئن ته pLK ڪنسنٽريشن وڌي ٿو (αS:pLK molar ratios of 1:0.5, 1:1.5, and 1:10 is inlightly green, green, and dark gree, क्रमशः).c Coacervate αS/pLK (molar ratio 1:10) at 25 µM (1 µM AF488-ليبل ٿيل αS يا Atto647N-ليبل ٿيل pLK WF اميجنگ لاءِ) LLPS بفر ۾ (مٿي) يا 500 mMtobot 1:10 کان پوءِ (کاٻي پاسي) %1,6-hexanediol (1,6-HD؛ هيٺان ساڄي).اسڪيل بار = 20 µm.d 25 μM جي ڪنسنٽريشن تي αS/pLK (مولر تناسب 1:10) جي BF قطرن جي فيوزن جون نمائندي خوردبيني تصويرون؛تير ظاهر ڪن ٿا انفرادي قطرن (ڳاڙهو ۽ پيلو تير) کي 200 ms جي اندر نئين قطري (نارنگي تير) ۾ ضم ڪرڻ) .اسڪيل بار = 20 µm.500 mM NaCl يا 10% 1,6-HD تي 25 µM αS (N = 3 نموني نقل، مطلب ۽ معياري انحراف پڻ اشارو ڪيو ويو آهي) تي روشني پکيڙڻ (350 nm تي) 500 mM NaCl يا 10% 1,6-HD جي اضافي کان اڳ LLPS بفر ۾ αS/pLK جمع.f BF تصوير (مٿي) ۽ 25 μM αS تي αS/pLK جي مجموعن جي روشني پکيڙڻ واري تجزيي (350 nm، هيٺان) αS:pLK molar ratio وڌائڻ سان (N = 3 نموني نقل، مطلب ۽ معياري انحراف پڻ اشارو ڪيو ويو آهي).اسڪيل بار = 10 µm.ھڪڙي تصوير تي اسڪيل بار ھڪڙي پينل ۾ سڀني تصويرن جي ماپ کي اشارو ڪري ٿو.خام ڊيٽا خام ڊيٽا فائلن جي صورت ۾ مهيا ڪئي وئي آهي.
αS/pLK electrostatic ڪمپليڪس ڪنڊينسيشن جي اسان جي مشاهدن جي بنياد تي ۽ αS جي اڳوڻي مشاهدن جي بنياد تي tau/RNA ڪنڊينسيٽ جي ڪلائنٽ ماليڪيول جي طور تي tau31 سان سڌي رابطي ذريعي، اسان اهو سمجهيو ته αS ۽ tau RNA جي غير موجودگيءَ ۾ محلول سان گڏجي الڳ ٿي سگهن ٿا. ڪنسنسيشن.electrostatic ڪمپليڪس ذريعي، ۽ αS αS/Tau coacervates ۾ اسڪوافڊ پروٽين آهي (ڏسو تائو چارج ورهائڻ تصوير 2e ۾).اسان ڏٺو ته جڏهن 10 μM αS ۽ 10 μM Tau441 (1 μM AF488-αS ۽ 1 μM Atto647N-Tau، ترتيب سان) LLPS بفر ۾ گڏ ڪيا ويا، انهن کي آساني سان پروٽينن جي مجموعي ٺاهي وئي جنهن ۾ ٻنهي پروٽينن تي مشتمل آهي، جيئن WF مائڪروپيپي پاران ڏٺو ويو آهي.(تصوير 2a).بوندن ۾ ٻن پروٽينن جي گڏ ٿيڻ جي تصديق ڪنفوڪل (CF) مائڪرو اسڪوپي (ضمني تصوير 1a) ذريعي ڪئي وئي.ساڳئي رويي جو مشاهدو ڪيو ويو جڏهن dextran-70 هڪ مجموعي ايجنٽ طور استعمال ڪيو ويو (ضمني تصوير. 1c).يا ته FITC-ليبل ٿيل PEG يا dextran استعمال ڪندي، اسان ڏٺا ته ٻئي گڏ ڪرڻ وارا ايجنٽ هڪجهڙائي سان نموني ۾ ورهايل هئا، ڏيکاريل نه ته جداگي ۽ نه ئي انجمن (ضمني تصوير. 1d).بلڪه، اهو مشورو ڏئي ٿو ته هن سسٽم ۾ اهي ميڪروموليڪولر ڪروڊنگ اثرات ذريعي مرحلن جي علحدگي کي فروغ ڏين ٿا، ڇاڪاڻ ته PEG هڪ ترجيحي طور تي مستحڪم ڪروڊنگ ايجنٽ آهي، جيئن ٻين LLP سسٽم ۾ ڏٺو ويو آهي 33,34.اهي پروٽين سان مالا مال قطرا NaCl (1 M) لاءِ حساس هئا پر 1,6-HD (10% v/v) لاءِ نه، انهن جي اليڪٽرروسٽيٽڪ خاصيتن جي تصديق ڪن ٿا (ضمني تصوير 2a، b).BF مائڪرو اسڪوپي (Fig. 2b) استعمال ڪندي مليسيڪنڊ ضم ڪرڻ واري قطرن جي واقعن کي مشاهدو ڪندي انهن جي سيال رويي جي تصديق ڪئي وئي.
αS/Tau441 جي هڪ Confocal (CF) مائڪرو اسڪوپي تصويرون LLPS بفر ۾ گڏ ٿين ٿيون (هر پروٽين جو 10 μM، AF488-ليبل ٿيل αS جو 0.5 μM ۽ Atto647N-ليبل ٿيل Tau441).b نمائندي فرق جي مداخلت جي برعڪس (DIC) αS/Tau441 قطرن جي فيوزن واقعن جون تصويرون (هر پروٽين لاءِ 10 μM).c فيز ڊاگرام تي ٻڌل روشني پکيڙڻ (350 nm تي) Tau441 LLPS (0–15 µM) جي غير موجودگي ۾ (کاٻي) يا موجودگي (ساڄي) 50 µM αS.گرم رنگ وڌيڪ پکيڙڻ جي نشاندهي ڪن ٿا.d αS/Tau441 LLPS نمونن جي روشني αS ڪنسنٽريشن وڌائڻ سان (Tau441 at 5 µM، N = 2–3 نموني ورجائي جيئن اشارو ڪيو ويو آهي).e ڪجهه تائو پروٽين جي مختلف قسمن جي اسڪيمياتي نمائندگي ۽ هن مطالعي ۾ استعمال ٿيل پروٽين جي مختلف علائقن: منفي طور تي چارج ٿيل اين ٽرمينل ڊومين (ڳاڙهو)، پرولين-امير علائقو (نيرو)، مائڪروٽيوبول-بائنڊنگ ڊومين (MTBD، نارنگي ۾ نمايان ٿيل)، ۽ amyloid ٺاهڻ وارو جوڙو سرپل.filament علائقا (PHF) MTBD (گرين) جي اندر واقع آهن.Tau441 جو Net Charge per Residue (NCPR) نقشو ڏيکاريو ويو آھي.f 1 µM AF488-ليبل ٿيل αS ۽ Atto647N-ليبل ٿيل ΔNt- استعمال ڪندي، ΔNt-Tau جي موجودگي ۾ 1 µM AF488-ليبل ٿيل αS يا ΔCt-αS استعمال ڪندي (مٿي، 10 µM في پروٽين) يا K18 (في µM µ5 پروٽين) ) ) ) LLPS يا K18 بفر ۾ ٺھيل WF جا مائڪرو گراف.ھڪڙي تصوير ۾ اسڪيل بار ھڪڙي پينل ۾ سڀني تصويرن جي ماپ جي نمائندگي ڪن ٿا (پينل a، b ۽ f لاءِ 20 µm).پينل سي ۽ ڊي لاء خام ڊيٽا خام ڊيٽا فائلن جي طور تي مهيا ڪيل آهن.
هن LLPS جي عمل ۾ αS جي ڪردار کي جانچڻ لاءِ، اسان پهريون ڀيرو NaCl (Fig. 2c) جي وڌندڙ ڪنسنٽريشن کي استعمال ڪندي نيفيلوميٽري ذريعي قطرن جي استحڪام تي αS جي اثر جي تحقيق ڪئي.αS تي مشتمل نمونن ۾ لوڻ جي ڪنسنٽريشن جيتري وڌيڪ هوندي، اوتري وڌيڪ روشني پکيڙيندڙ قدر (350 nm تي)، جيڪا هن LLPS سسٽم ۾ αS جي مستحڪم ڪردار کي ظاهر ڪري ٿي.ھڪڙو ساڳيو اثر αS ڪنسنٽريشن (۽ تنھنڪري αS: Tau441 تناسب) کي تقريباً وڌائڻ سان ڏسي سگھجي ٿو.تائو ڪنسنٽريشن (5 µM) (تصوير 2d) جي نسبت 10-گنا واڌارو.اهو ظاهر ڪرڻ لاءِ ته αS coacervates ۾ هڪ اسڪيل پروٽين آهي، اسان LLPS-خراب ٿيل ٽائو ميوٽنٽ جي رويي جي تحقيق ڪرڻ جو فيصلو ڪيو، جنهن ۾ هڪ منفي طور تي چارج ٿيل N-ٽرمينل علائقو نه آهي (باشيا 1-150، ڏسو تصوير. 2e) ΔNt-Tau سڏيو ويندو آهي.WF microscopy ۽ nephelometry جي تصديق ڪئي وئي آهي ته ΔNt-Tau پاڻ LLPS (Fig. 2f ۽ Supplementary Fig. 2d) کان نه گذريو آهي، جيئن اڳ ۾ ٻڌايو ويو آهي 14. جڏهن ته، جڏهن αS کي شامل ڪيو ويو ته هن ٽوڙيل ٽائو قسم جي تڪراري حل ۾، LLPS عمل مڪمل طور تي هو. ٽائو ۽ αS جي مڪمل سائز جي حلن جي قطرن جي کثافت جي ويجهو قطرن جي کثافت سان بحال ڪئي وئي ساڳئي حالتن ۽ پروٽين جي ڪنسنٽريشن تحت.اهو عمل پڻ گهٽ ميڪروموليڪيولر گرائونڊنگ جي حالتن ۾ مشاهدو ڪري سگهجي ٿو (ضمني تصوير. 2c).سي-ٽرمينل αS علائقي جو ڪردار، پر ان جي پوري ڊگھائي نه، ايل ايل پي ايس جي عمل ۾ ظاھر ڪئي وئي قطري ٺاھڻ جي روڪٿام کي استعمال ڪندي ھڪ سي-ٽرمينل ٽرمينل αS ويرينٽ جي گھٽتائي جي گھٽتائي 104-140 (تصوير 1a) جي (ΔCt- αS) پروٽين (Fig. 2f ۽ Supplementary Fig. 2d).αS ۽ ΔNt-Tau جي گڏيل سازي جي تصديق ڪئي وئي confocal fluorescence microscopy (ضمني تصوير. 1b).
Tau441 ۽ αS جي وچ ۾ LLPS ميڪانيزم کي وڌيڪ جانچڻ لاءِ، هڪ اضافي Tau variant استعمال ڪيو ويو، يعني microtubule-binding domain (MTBD) ۾ جوڙيل helical filament core (PHF) ٽڪڙو، جيڪو جيڪڏهن ان ۾ چار خصوصيتون ريپٽ ڊومينز تي مشتمل هجي، عام طور تي پڻ سڃاتو وڃي ٿو. جيئن K18 ٽڪرا (ڏسو تصوير. 2e).اهو تازو ٻڌايو ويو آهي ته αS ترجيحي طور تي هڪ پرولين امير ڊومين ۾ واقع هڪ ٽائو پروٽين سان جڙيل آهي هڪ تسلسل ۾ جيڪو مائڪروٽيوبول بائنڊنگ ڊومين کان اڳ آهي.بهرحال، PHF علائقو مثبت طور تي چارج ٿيل ريزيديوشن سان پڻ مالا مال آهي (ڏسو شڪل 2e)، خاص طور تي لائسين (15٪ باقيات)، جنهن اسان کي جانچڻ لاءِ چيو ته ڇا هي علائقو αS/Tau ڪمپليڪس جي ڪنڊينسيشن ۾ به حصو ڏئي ٿو.اسان ڏٺو ته K18 اڪيلو LLPS کي 100 μM تائين ڪنسنٽريشن تي نه ٿي سگھي ٿو آزمائشي حالتن جي تحت (LLPS بفر 15٪ PEG يا 20٪ dextran سان) (شڪل 2f).بهرحال، جڏهن اسان 50 µM αS کي 50 µM K18 ۾ شامل ڪيو، K18 ۽ αS تي مشتمل پروٽين جي بوندن جي تيزيءَ سان ٺهڻ جو مشاهدو نيفيلوميٽري (ضمني شڪل 2d) ۽ WF مائڪرو اسڪوپي (تصوير 2f) ذريعي ڪيو ويو.جيئن توقع ڪئي وئي، ΔCt-αS K18 (Fig. 2f) جي LLPS رويي کي بحال ڪرڻ جي قابل نه هئي.اسان ياد رکون ٿا ته αS/ΔNt-Tau يا αS/Tau441 جي مقابلي ۾ αS/K18 گڏ ڪرڻ لاءِ LLPS کي وڌائڻ لاءِ ٿورڙي وڌيڪ پروٽين جي مقدار جي ضرورت آهي، ٻيون شيون برابر آهن.اهو αS سي-ٽرمينل علائقي جي مضبوط رابطي سان مطابقت رکي ٿو پرولين-امير ٽاؤ ڊومين سان مائڪروٽيوبول-بائنڊنگ ڊومين جي مقابلي ۾، جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي 31.
ڏنو ويو آهي ته ΔNt-Tau αS جي غير موجودگي ۾ LLPS انجام نه ٿو ڏئي سگهي، اسان هن Tau variant کي αS/Tau LLPS جي خصوصيت لاءِ ماڊل طور چونڊيو آهي ان جي سادگي LLPS سسٽم ۾ مڪمل ڊگھائي ٽائو (آئسوٽائپ، Tau441/Tau441).پيچيده (heterotypic، αS/Tau441) گڏ ڪرڻ واري عمل سان.اسان αS جي مجموعي جي درجي جي مقابلي ۾ (ڪندا ٿيل مرحلي جي پروٽين، fαS،c جي حصي جي طور تي) αS/Tau ۽ αS/ΔNt-Tau سسٽم ۾ سينٽرفيوگريشن ۽ منتشر مرحلو SDS-PAGE تجزيي (ڏسو 2e)، تمام ملندڙ قدر مليا. ساڳئي ڪنسنٽريشن تي سڀني پروٽين لاء.خاص طور تي، اسان حاصل ڪيو fαS,c 84 ± 2% ۽ 79 ± 7% αS/Tau ۽ αS/ΔNt-Tau لاءِ ترتيبوار، اهو تجويز ڪيو ته αS ۽ tau جي وچ ۾ heterotypic تعامل tau molecules جي وچ ۾ رابطي کان بهتر آهي.وچ ۾.
مختلف پوليڪيشنز سان رابطي ۽ αS ڪينيٽيڪس تي ڪنڊيشن جي عمل جو اثر پهريون ڀيرو فوٽوبلچنگ (FRAP) طريقي کان پوء فلوروسينس وصولي ذريعي اڀياس ڪيو ويو.اسان αS/Tau441، αS/ΔNt-Tau ۽ αS/pLK coacervates کي آزمايو (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS ۽ 100 μM Tau441 يا ΔNt-Tau يا 1 mM pLK سان پورو ڪيو ويو).ڊيٽا حاصل ڪئي وئي پهرين 30 منٽن اندر نموني جي اجزاء کي گڏ ڪرڻ کان پوء.نمائندي FRAP تصويرن مان (Fig. 3a، αS/Tau441 ڪنڊينسيشن) ۽ انھن سان لاڳاپيل ٽائيم ڪورس وکر (Fig. 3b، ضمني شڪل 3)، اھو ڏسي سگھجي ٿو ته αS ڪينيٽيڪس تمام گھڻو ملندڙ آھن انھن Tau441 coacervates سان.۽ ΔNt-Tau، جيڪو تمام گهڻو تيز آهي pLK سان.αS لاءِ ڳڻيل diffusion coefficients اندر coacervate FRAP مطابق (جيئن بيان ڪيل ڪانگ et al. 35) آهن D = 0.013 ± 0.009 µm2/s ۽ D = 0.026 ± 0.008 µm2/s αS/TauΔS/Tau4 لاءِ αS/Tau4. αS/ سسٽم.pLK، Tau، ۽ D = 0.18 ± 0.04 µm2/s، ترتيب سان (تصوير 3c).جڏهن ته، منتشر ٿيل مرحلي ۾ diffusion coefficient αS سڀني ڪنڊينسڊ مرحلن کان وڌيڪ شدت جا ڪيترائي آرڊر آهن، جيئن فلورسنس ڪوريليشن اسپيڪٽرو اسڪوپي (FCS، ڏسو ضمني تصوير 3) ساڳئي حالتن هيٺ (LLPS بفر) پر پوليڪيشن جي غير موجودگيءَ ۾ (ڊي = 8 ± 4 µm2/s).تنهن ڪري، αS ترجمي جي ڪينيٽيڪس خاص طور تي منتشر ٿيل مرحلن ۾ پروٽين جي مقابلي ۾ coacervates ۾ خاص طور تي گهٽجي وئي آهي ڇاڪاڻ ته واضح ماليڪيولر ڪائوڊنگ اثرات جي ڪري، جيتوڻيڪ سڀئي coacervates انهن جي ٺهڻ کان پوء پهرين اڌ ڪلاڪ دوران مائع جهڙي خاصيتون برقرار رکنديون آهن، تائو مرحلي جي ابتڙ.pLK condensate ۾ تيز رفتار kinetics.
a-c αS متحرڪات جو FRAP تجزيو (2% AF488-ليبل ٿيل αS) electrostatic coacervates ۾.αS/Tau441 FRAP assays جي نمائندن جون تصويرون ٽنهي ۾ ڏيکاريل آهن (a)، جتي ڳاڙهي حلقن کي رنگين علائقن جي نشاندهي ڪن ٿا.اسڪيل بار 5 µm آهي.b اوسط FRAP وکر ۽ (c) 5-6 (N) لاءِ 100 µM αS ۽ Tau441 (لال) يا ΔNt-Tau (نيرو) يا pLK (سائي) جي برابر ڪنسنٽريشن استعمال ڪندي ٽن تجربن مان مختلف قطرن لاءِ 5-6 (N) لاءِ ڳڻيل ڊفيوشن ڪوفيسينٽس (D) LLPS جي ڪنسنٽريشن کان ڏهه ڀيرا.FRAP وکر جي معياري انحراف ڇانو رنگ ۾ ڏيکاريل آهي.مقابلي لاءِ، منتشر ٿيل مرحلي ۾ diffusion coefficient αS fluorescence correlation spectroscopy (FCS) استعمال ڪندي ٽن حصن ۾ طئي ڪيو ويو (ڏسو ضمني شڪل 3 ۽ طريقا وڌيڪ معلومات لاءِ).d مسلسل X-band EPR اسپيڪٽرا 100 μM TEMPOL-122-αS LLPS بفر ۾ بغير ڪنهن پوليڪيشن (ڪارو) يا 100 μM Tau441 (لال) يا ΔNt-Tau (نيري) يا 1 mM pLK (سائي) جي موجودگي ۾.انسيٽ مضبوط فيلڊ لائنن جو هڪ وڏو نظارو ڏيکاري ٿو جتي سڀ کان وڌيڪ ڊرامائي تبديليون ٿينديون آهن.50 μM TEMPOL-122-αS جا پابند وکر LLPS جي غير موجودگيءَ ۾ مختلف پوليڪيشنز سان (نه PEG).عام ٿيل EPR اسپيڪٽرم جي بينڊ II (IIII / III) جي مقابلي ۾ بينڊ III جي گھٽتائي طول و عرض ڏيکاريو ويو آهي ته Tau441 (لال)، ΔNt-Tau (نيري) ۽ pLK (سائي) جي مولر تناسب کي وڌائڻ لاء.رنگين سٽون ڏيکارين ٿيون ڊيٽا کي مناسب بائنڊنگ ماڊل استعمال ڪندي هر وکر تي n هڪجهڙائي ۽ آزاد بائنڊنگ سائيٽن سان.خام ڊيٽا خام ڊيٽا فائلن جي صورت ۾ مهيا ڪيل آهن.
هڪ مڪمل طور تي، اسان هدايت ڪيل اسپن ليبلنگ (SDSL) ۽ مسلسل اليڪٽران پيرا مقناطيسي گونج (CW-EPR) استعمال ڪندي مختلف coacervates ۾ αS جي متحرڪات جي تحقيق ڪئي.اهو طريقو IDP جي لچڪداريءَ ۽ متحرڪيءَ کي رپورٽ ڪرڻ ۾ تمام ڪارائتو ثابت ٿيو آهي، هڪ حقيقي ريزوليوشن 36,37,38 سان.انهي جي پڇاڙيء ۾، اسان واحد Cys ميوٽنٽ ۾ سيسٽين جي رهائشي تعمير ڪئي ۽ 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) اسپن پروب استعمال ڪيو.Maleimide derivatives انھن کي ليبل.وڌيڪ خاص طور تي، اسان پوزيشن 122 يا 24 αS (TEMPOL-122-αS ۽ TEMPOL-24-αS) تي TEMPOL تحقيقات داخل ڪيو.پهرين صورت ۾، اسان پروٽين جي سي ٽرمينل علائقي کي نشانو بڻايو، جيڪو پوليڪيشن سان رابطي ۾ شامل آهي.ان جي بدران، پوزيشن 24 اسان کي کنڊنسيٽ ۾ پروٽين جي مجموعي متحرڪ بابت معلومات ڏئي سگهي ٿي.ٻنهي صورتن ۾، منتشر ٿيل مرحلن جي پروٽينن لاء حاصل ڪيل EPR سگنل تيز رفتار واري حالت ۾ نائيٽروڪسائيڊ ريڊيڪلز سان ملن ٿا.تاؤ يا pLK (100 μM TEMPOL-αS، Tau441 يا ΔNt-Tau 1:1 جي تناسب تي يا 1:10 جي تناسب تي pLK) جي موجودگي ۾ مرحلي جي علحدگيءَ کان پوءِ، نسبتي چوٽي جي شدت ۾ اضافو ڏٺو ويو. αS جو EPR اسپيڪٽرم.نقصان جي لڪير وسيع ٿي وئي، اشارو ڪيو ويو ته قطرن ۾ گھٽ αS جي بحالي واري ڪينيٽيڪس گھٽجي وئي پروٽين جي ڀيٽ ۾ گھٽجي مرحلي ۾ (تصوير 3d، ضمني تصوير. 4a).اهي تبديليون پوزيشن 122 تي وڌيڪ واضح آهن. جڏهن ته پوزيشن 24 تي pLK جي موجودگي تحقيق جي ڪينيٽيڪس کي متاثر نه ڪيو، پوزيشن 122 تي اسپيڪٽرل لائن جي شڪل ۾ وڏي تبديلي آئي (ضمني شڪل 4a).جڏهن اسان ٻه αS/پوليڪيشن سسٽم جي پوزيشن 122 تي اسپيڪٽرا کي ماڊل ڪرڻ جي ڪوشش ڪئي آئوٽروپڪ ماڊل (ضمني شڪل 5a) استعمال ڪندي عام طور تي اسپين-ليبل IDP38,39 جي متحرڪ بيان ڪرڻ لاءِ، اسان تجرباتي اسپيڪٽرا کي ٻيهر ٺاهڻ ۾ ناڪام هئاسين..24 اسپن جي تضاد جي پوزيشن جو اسپيڪٽرل تخليق (ضمني تصوير 5a).اهو مشورو ڏئي ٿو ته پوليڪيشن جي موجودگي ۾ αS جي سي-ٽرمينل علائقي جي اسپين ترتيبن جي خلا ۾ ترجيحي پوزيشن موجود آهن.جڏهن αS جي ڀاڱي تي غور ڪيو وڃي ٿو ڪنسڊڊ مرحلي ۾ تجرباتي اي پي آر جي حالتن هيٺ (84 ± 2٪، 79 ± 7٪، ۽ 47 ± 4٪ αS/Tau441، αS/ΔNt-Tau، ۽ αS/pLK لاءِ، ترتيب سان- ڏسو ضمني تصوير. 2e ڊيٽا جي تجزيي جي c)، اهو ڏسي سگهجي ٿو ته اي پي آر جي طريقي سان دريافت ڪيل وسيعيت بنيادي طور تي αS جي سي-ٽرمينل علائقي جي رابطي کي ظاهر ڪري ٿو مختلف پوليڪيشنز سان گڏ ڪنڊينسڊ مرحلي ۾ (مکيه تبديلي جڏهن استعمال ڪندي TEMPOL-122- αS)، ۽ نه پروٽين ڪنسنسيشن.تحقيق ۾ microviscosity ۾ اضافو ڏٺو ويو آهي.جيئن توقع ڪئي وئي، ايل ايل پي ايس کان سواء ٻين حالتن جي تحت پروٽين جو اي پي آر اسپيڪٽرم مڪمل طور تي بحال ڪيو ويو جڏهن 1 M NaCl مرکب ۾ شامل ڪيو ويو (ضمني تصوير. 4b).مجموعي طور تي، اسان جي ڊيٽا جو مشورو ڏنو ويو آهي ته CW-EPR پاران معلوم ڪيل تبديليون بنيادي طور تي αS جي سي-ٽرمينل علائقي جي رابطي کي ظاهر ڪن ٿيون مختلف پوليڪيشنز سان گڏ ڪنسڊڊ مرحلن ۾، ۽ اهو تعامل ظاهر ٿئي ٿو تائو جي ڀيٽ ۾ pLK سان مضبوط.
coacervate ۾ پروٽين جي باري ۾ وڌيڪ ساخت جي معلومات حاصل ڪرڻ لاء، اسان حل ۾ NMR استعمال ڪندي LLPS سسٽم جو مطالعو ڪرڻ جو فيصلو ڪيو.تنهن هوندي، اسان صرف منتشر ٿيل مرحلي ۾ باقي αS حصو ڳولي سگهون ٿا، جيڪو شايد ٿي سگهي ٿو گھٽ پروٽين جي متحرڪ اندر coacervate ۽ NMR تجزيي ۾ حل جي تري ۾ هڪ گھڻ وارو مرحلو.جڏهن اسان اين ايم آر (ضمني شڪل 5c، ڊي) استعمال ڪندي ايل ايل پي ايس نموني جي منتشر ٿيل مرحلي ۾ باقي رهيل پروٽين جي ساخت ۽ متحرڪ جو تجزيو ڪيو، اسان ڏٺو ته پروٽين تقريبن هڪجهڙائي سان عمل ڪيو pLK ۽ ΔNt-Tau، ٻنهي جي موجودگي ۾. جيڪي ثانوي ڍانچي ۾ هئا ۽ پروٽين جي پٺي جي هڏن جي متحرڪ، ثانوي ڪيميائي شفٽ ۽ R1ρ آرام تي تجربن ذريعي ظاهر ڪيو ويو آهي.NMR ڊيٽا ڏيکاري ٿو ته αS جو C-terminus conformational flexibility جو هڪ اهم نقصان برداشت ڪري ٿو جڏهن ته ان جي بي ترتيبي طبيعت کي برقرار رکندي، باقي پروٽين جي تسلسل وانگر، پوليڪيشنز سان ان جي رابطي جي ڪري.
جيئن ته TEMPOL-122-αS ۾ CW-EPR سگنل جي وسيع ٿيڻ جو مشاهدو ڪيو ويو ڪنڊينسڊ مرحلي ۾ پوليڪيشنز سان پروٽين جي رابطي کي ظاهر ڪري ٿو، اسان ايل ايل پي ايس جي غير موجودگي ۾ αS جي پابند لاڳاپي جو اندازو لڳائڻ لاءِ EPR ٽائٽريشن ڪيو (جنهن جو ڪو جمع ناهي. بفر ايل ايل پي ايس)، اهو مشورو ڏئي ٿو ته تعاملات هڪجهڙائي ۽ مرڪوز مرحلن ۾ ساڳيا آهن (جنهن جي تصديق اسان جي ڊيٽا، ضمني تصوير 4a ۽ ضمني تصوير 6) ڪندي آهي.مقصد اهو ڏسڻ هو ته ڇا سڀئي ڪوسرويٽس، انهن جي عام سيال جهڙي ملڪيت جي باوجود، ماليڪيولر سطح تي ڪنهن به بنيادي فرق واري رويي کي ظاهر ڪن ٿا.جيئن توقع ڪئي وئي، اي پي آر اسپيڪٽرم وڌندڙ پوليڪيشن ڪنسنٽريشن سان وسيع ٿي ويو، تقريبن سڀني رابطي جي ڀائيوارن جي ماليڪيولر رابطي جي سبب ماليڪيولر لچڪ ۾ گھٽتائي کي ظاهر ڪري ٿو (Fig. 3e، ضمني تصوير. 6).pLK هن سنترپشن کي ΔNt-Tau ۽ Tau441 جي مقابلي ۾ گهٽ مولر تناسب (polycation:αS) تي حاصل ڪيو.حقيقت ۾، ڊيٽا جي مقابلي ۾ هڪ لڳ ڀڳ پابند ماڊل سان فرض ڪيو ويو آهي n هڪجهڙائي ۽ آزاد بائنڊنگ سائيٽن کي ظاهر ڪيو ويو آهي ته pLK (~ 5 μM) جي ظاهري تقسيم مسلسل Tau441 يا ΔNt-Tau (~ 50 μM) جي ڀيٽ ۾ گھٽ شدت جو حڪم آهي. ).µM).جيتوڻيڪ اھو ھڪڙو اندازو آھي، اھو مشورو ڏئي ٿو ته αS کي مسلسل مثبت چارج وارن علائقن سان آسان پوليڪيشنز لاءِ وڌيڪ لاڳاپو آھي.αS ۽ مختلف پوليڪيشنز جي وچ ۾ لاڳاپي ۾ هن فرق کي ڏنو ويو، اسان اهو سمجهيو ته انهن جي مائع ملڪيت مختلف وقت سان تبديل ٿي سگهي ٿي ۽ اهڙيء طرح مختلف LSPT عملن کان متاثر ٿين ٿا.
پروٽين جي coacervate ۽ پروٽين جي amyloid فطرت جي اندر انتهائي ڀريل ماحول کي ڏنو ويو، اسان ممڪن LSPT عملن کي ڳولڻ لاء وقت جي مٿان coacervate جي رويي جو مشاهدو ڪيو.BF ۽ CF مائڪرو اسڪوپي کي استعمال ڪندي (شڪل 4)، اسان ڏٺو ته αS/Tau441 وڏي حد تائين حل ۾ گڏ ٿين ٿا، وڏا قطرا ٺاهيندا آهن جيڪي کوهه جي تري ۾ مٿاڇري سان رابطو ڪندا آهن ۽ مڪمل قطرن جي طور تي سلائڊ ڪندا آهن، جيئن توقع ڪئي وئي (ضمني شڪل. 7d)؛اسان انهن هيٺان ٺهيل اڏاوتن کي ”پروٽين رافٽس“ چوندا آهيون.اهي اڏاوتون فلاڻي رهيون آهن جيئن اهي فيوز ڪرڻ جي صلاحيت برقرار رکندا آهن (ضمني شڪل 7b) ۽ LLPS شروع ٿيڻ کان پوءِ ڪيترن ئي ڪلاڪن تائين ڏسي سگهجن ٿا (تصوير 4 ۽ ضمني شڪل 7c).اسان ڏٺو آهي ته ويٽنگ جو عمل هائيڊروفوبڪ مواد (ضمني شڪل 7a) جي بجاءِ هائيڊروفيلڪ جي مٿاڇري تي پسند ڪيو ويندو آهي، جيئن غير متوازن چارجز سان اليڪٽررو اسٽيٽڪ ڪوسرويٽس لاءِ توقع ڪئي ويندي آهي ۽ اهڙيءَ طرح اعليٰ اليڪٽررو اسٽيٽڪ مٿاڇري جي امڪانن سان.خاص طور تي، αS/ΔNt-Tau coalescence ۽ رافنگ خاص طور تي گهٽجي ويا، جڏهن ته αS/pLK ڪنڊينٽس خاص طور تي گهٽجي ويا (تصوير 4).مختصر انڪيوبيشن واري وقت دوران، αS/pLK بوند گڏ ڪرڻ جي قابل هئا ۽ هائيڊروفيلڪ سطح کي گلي ڪرڻ جي قابل هئا، پر اهو عمل جلدي بند ٿي ويو ۽ انڪيوبيشن جي 5 ڪلاڪن کان پوء، صرف محدود گڏيل واقعا ۽ ڪو به ويٽنگ نه ڏٺو ويو.- جيل-ڊرپ جي منتقلي.
نمائندو BF (گريس اسڪيل پينل) ۽ CF (ساڄي پينل، سائي ۾ AF488-ليبل ٿيل αS) ڪوسرويٽ نموني جا 100 µM αS (1% فلوروسينٽ ليبل) LLPS بفر ۾ 100 µM Tau488 microscΔpictoop image) جي موجودگي ۾. -ٽائو (وچ) يا 1 ايم ايم pLK (هيٺ) مختلف انڪيوبيشن وقتن ۽ مرڪزي اونچائي تي (z، پليٽ جي هيٺان کان مفاصلو چڱي طرح).تجربن کي بار بار ڪيو ويو 4-6 ڀيرا هڪ ٻئي کان آزاديء سان ساڳئي نتيجن سان.αS/Tau441 coacervates 24 ڪلاڪن کان پوءِ ويٽ ڪيا ويندا آهن، تصوير کان وڏا رافٽ ٺاهيندا آهن.سڀني تصويرن لاء اسڪيل بار 20 µm آهي.
اسان پوءِ پڇيو ته ڇا αS/Tau441 LLPS ۾ ٺھيل وڏا فلائڊ جھڙا پروٽين جا تلاءَ پڙھيل ڪنھن به پروٽين جي ايميلائيڊ ايگريگيشن کي ڏسندا.اسان αS/Tau441 بوندن جي پختگي جي پيروي ڪئي وقت سان گڏ WF مائڪرو اسڪوپي سان ساڳئي حالتن ۾، پر 1 μM AF488-ليبل ٿيل αS ۽ Atto647N-ليبل ٿيل Tau441 (Fig. 5a) استعمال ڪندي.جيئن توقع ڪئي وئي، اسان مڪمل پروٽينن جي مڪانيزيشن کي پوري پوري عمل ۾ ڏٺو.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته ca.5 ڪلاڪن کان پوءِ، رافٽس جي اندر وڌيڪ شديد غير سرڪيولر اڏاوتون ڏٺيون ويون، جن کي اسان ”پوائنٽ“ سڏيندا آهيون، جن مان ڪي αS سان گڏ ڪيل هئا، ۽ ڪي Tau441 (Fig. 5a، اڇا تير) ۾ نفيس هئا.αS/ΔNt-Tau جي ڀيٽ ۾ αS/ΔNt-Tau لاءِ وڏي حد تائين رافٽس جي اندر اهي داغ هميشه ڏٺا ويا آهن.pLK ۽ Tau سسٽم جي بوندن ۾ ڪي به ڌار ڌار اسپاٽ نه هئا فيوزن / ويٽنگ لاءِ ناگزير.جانچڻ لاءِ ته ڇا اهي داغ جن ۾ αS ۽ Tau441 شامل آهن amyloid-like aggregates آهن، اسان CF microscopy استعمال ڪندي ساڳيو تجربو ڪيو جنهن ۾ Tau441 Atto647N سان ليبل ڪيو ويو ۽ 12.5 μM amyloid-specific thioflavin-T (ThT) شروع کان شامل ڪيو ويو.رنگڻ.جيتوڻيڪ αS/Tau441 بوندن يا رافٽس جو ThT-staining 24 h incubation کان پوءِ به نه ڏٺو ويو (Fig. 5b، مٿين قطار- باقي بچيل قطرا پروٽين رافٽس مٿان)، ThT-مثبت ڍانچيون جن ۾ Atto647N-Tau441 شامل آهن، ڏاڍا ڪمزور هئا.هي اڳ ۾ بيان ڪيل اسپاٽ جي سائيز، شڪل ۽ مقام کي نقل ڪري ٿو (تصوير 5b، وچين ۽ هيٺيون قطارون)، اهو مشورو ڏئي ٿو ته اهي داغ عمر جي فلوئڊ ڪوسرويٽس ۾ ٺهيل امائلائڊ جھڙي مجموعن سان ملن ٿا.
WF 25 μM αS مختلف انڪيوبيشن جي وقتن تي ۽ مرڪزي اونچائي تي (z، اڻڄاڻ هيٺان کان فاصلو) 25 μM Tau441 جي موجودگي ۾ (1 μM AF488-ليبل ٿيل αS ۽ Atto647N-ليبل ٿيل Tau441) LLPS buffer سان مائڪرو اسڪوپ پليٽ جي کوهه ۾) .ڇهه تجربا آزاديء سان ساڳي نتيجن سان بار بار ڪيا ويا.b CF خوردبيني تصوير 25 μM αS جي موجودگي ۾ 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-labeled Tau441) ۽ 12.5 μM thioflavin-T (ThT).وزن وارا پروٽين جا ڦڙا ۽ جمع ٿيل پروٽين جا ڦڙا ۽ اسپاٽ مٿي ۽ وچين قطارن ۾ ڏيکاريا ويا آهن.هيٺئين قطار ڏيکاري ٿي رافٽس جون تصويرون ۽ 3 آزاد نقلن مان ڦڙا.اڇا تير ٻنهي پينلن ۾ ThT-مثبت نقطا ظاهر ڪن ٿا.سڀني تصويرن لاء اسڪيل بار 20 µm آهي.
وڌيڪ تفصيل سان معائنو ڪرڻ لاءِ coacervate پروٽين نيٽ ورڪ ۾ تبديلين جي منتقلي دوران مائع کان سڪل تائين، اسان استعمال ڪيو فلوروسينس لائف ٽائيم اميجنگ (FLIM) ۽ Förster resonance energy transfer microscopy (FRET) (شڪل 6 ۽ ضمني انگ اکر 8 ۽ 9).اسان اهو تصور ڪيو آهي ته پرت جي کوٽائي جي پختگي هڪ وڌيڪ ٿلهي يا اڃا به مضبوط-جهڙي مجموعي پروٽين جي جوڙجڪ ۾ پروٽين ۽ ان سان ڳنڍيل فلورسنٽ پروب جي وچ ۾ ويجهي رابطي جي ڪري ٿي، ممڪن طور تي هڪ quenching اثر پيدا ڪري ٿو جيڪو هڪ مختصر تحقيق جي زندگي ۾ ظاهر ٿئي ٿو (τ) جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي 40.41،42.ان کان علاوه، ڊبل ليبل ٿيل نمونن لاءِ (AF488 ۽ Atto647N جيئن FRET ڊونر ۽ قبول ڪندڙ رنگ، ترتيب سان)، τ ۾ اها گهٽتائي پڻ ٿي سگهي ٿي coacervate condensation ۽ LSPT دوران FRET(E) ڪارڪردگي ۾ اضافو.اسان LLPS αS/Tau441 ۽ αS/ΔNt-Tau نموني ۾ وقت سان گڏ راف ۽ اسپاٽ ٺاھڻ جي نگراني ڪئي (ايل ايل پي ايس بفر ۾ ھر پروٽين جو 25 µM 1 µM AF488 ليبل ٿيل αS ۽/يا Atto647N ليبل ٿيل Tau441 يا ΔNt-Tau).اسان هڪ عام رجحان ڏٺو آهي ته AF488 (τ488) ۽ Atto647N (τ647N) پروبس جي فلوروسينس لائف ٽائيم ٿوري گھٽجي وئي جيئن ڪوسرويٽس پختو ٿي ويا (تصوير 6 ۽ ضمني تصوير. 8c).دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، هي تبديلي خاص طور تي رافٽس (Fig. 6c) جي اندر ڊٽس لاءِ وڌي وئي هئي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته ڊٽس تي وڌيڪ پروٽين جي ڪنڊينسيشن واقع ٿي.ان جي حمايت ۾، αS/ΔNt-Tau بوندن جي عمر ۾ 24 h (ضمني شڪل 8d) لاءِ فلوروسينس لائف ٽائيم ۾ ڪا خاص تبديلي نه آئي، ان مان معلوم ٿئي ٿو ته قطرن جي جلي هڪ عمل آهي جيڪو اسپاٽنگ کان الڳ آهي ۽ اهو اهم ماليڪيولر ري آرگنائيزيشن سان گڏ ناهي. coacervates جي اندر.اهو ياد رکڻ گهرجي ته ڊٽس αS ۾ مختلف سائيز ۽ متغير مواد آهن، خاص طور تي αS/Tau441 سسٽم لاءِ (ضمني تصوير 8e).اسپاٽ فلورسنس جي زندگي جي گھٽتائي سان گڏ شدت ۾ اضافو ٿيو، خاص طور تي Atto647N ليبل ٿيل Tau441 (ضمني شڪل 8a)، ۽ اعلي FRET ڪارڪردگي ٻنهي αS / Tau441 ۽ αS / ΔNt-Tau سسٽم لاء، اشارو ڪندي پنجن ڪلاڪن ۾ وڌيڪ ڪنڊيشنز. حرڪت ڪرڻ کان پوءِ، جامد بجليءَ جي اندر موجود پروٽينن کي ڪننس ڪيو ويو.αS/ΔNt-Tau جي مقابلي ۾، اسان αS/Tau441 جڳهن ۾ هيٺين τ647N ۽ ڪجهه وڌيڪ τ488 قدر ڏٺو، ان سان گڏ هيٺين ۽ وڌيڪ غير معمولي FRET قدر.ممڪن طور تي، اهو شايد انهي حقيقت سان لاڳاپيل هجي ته αS/Tau441 سسٽم ۾، مجموعي ۾ مشاهدو ۽ متوقع αS جي گهڻائي وڌيڪ متضاد آهي، اڪثر ڪري Tau جي مقابلي ۾ سبسٽوچيوميٽرڪ، ڇو ته Tau441 پاڻ شايد LLPS ۽ مجموعن مان گذري سگھي ٿو (ضمني شڪل 8e) .جڏهن ته، قطرن جي گڏ ٿيڻ جو درجو، راف ٺهڻ، ۽، اهم طور تي، پروٽين جي مجموعي ۾ مائع-جهڙوڪ ڪوسرويٽس تمام گهڻو آهي جڏهن Tau441 ۽ αS موجود آهن.
αS/Tau441 ۽ αS/ΔNt-Tau جون 25 μM تي هر پروٽين (1 μM AF488-ليبل ٿيل αS ۽ 1 μM Atto647N-ليبل ٿيل Tau441 يا ΔNt-Tau) LLPS buff ۾ هڪ لائف ٽائيم فلوروسينس مائڪرو اسڪوپي (FLIM) تصويرون.ڪالمن ڏيکارين ٿا LLPS نمونن جا نمائندا تصويرون مختلف پختگي جي وقتن تي (30 منٽ، 5 h ۽ 24 h).ڳاڙهو فريم ڏيکاري ٿو علائقو جنهن ۾ αS/Tau441 اسپاٽ شامل آهن.زندگي جي اسپن کي رنگ جي بارن وانگر ڏيکاريو ويو آهي.اسڪيل بار = 20 µm سڀني تصويرن لاءِ.b منتخب ٿيل علائقي جي FLIM تصوير کي زوم ڪيو، پينل الف ۾ ڳاڙهي باڪس ۾ ڏيکاريل آهي.زندگي جون حدون ڏيکاريل آھن ساڳيا رنگ اسڪيل استعمال ڪندي جيئن پينل الف ۾.اسڪيل بار = 5 µm.c هسٽوگرام ڏيکاريندڙ AF488 (αS سان جڙيل) يا Atto647N (Tau سان جڙيل) مختلف پروٽين جي نسلن لاءِ (droplets-D-، raft-R- ۽ speckle-P) جي سڃاڻپ FLIM تصويرن ۾ جيڪي αS- لاءِ رڪارڊ ٿيل آهن، ٽائمنگ ڊسٽريبيوشن لائف ٽائم ٽائو441 ۽ αS/ΔNt-Tau coacervate نموني (N = 17-32 ROI D لاءِ، 29-44 ROI R لاءِ، ۽ 21-51 ROI پوائنٽس لاءِ).وچين ۽ وچين قدرن کي بالترتيب دٻي جي اندر پيلي چوڪن ۽ ڪارا لڪير طور ڏيکاريا ويا آهن.دٻي جا هيٺيون ۽ مٿيون حدون ترتيبوار پهرين ۽ ٽئين چوٿين جي نمائندگي ڪن ٿيون، ۽ 1.5-فولڊ انٽرڪوارٽائل رينج (IQR) اندر گهٽ ۾ گهٽ ۽ وڌ ۾ وڌ قدر ويسڪرز طور ڏيکاريا ويا آهن.ٻاهران ڪاري هيرن طور ڏيکاريا ويا آهن.تقسيم جي جوڑوں جي وچ ۾ شمارياتي اهميت جو اندازو لڳايو ويو هڪ ٻه-نمونون ٽي-ٽيسٽ استعمال ڪندي، فرض ڪيو ويو غير مساوي فرق.ٻه طرفي ٽي-ٽيسٽ پي-قدر ڏيکاريا ويا آهن ستارن سان هر هڪ مقابلي واري ڊيٽا جي لاءِ (* p-value> 0.01, ** p-value> 0.001, *** p-value> 0.0001, **** p-value> 0.00001)، ns ظاهر ڪري ٿو غفلت (p-value> 0.05).صحيح پي ويلز ضمني جدول 1 ۾ ڏنل آهن، ۽ اصل ڊيٽا خام ڊيٽا فائلن جي طور تي پيش ڪيا ويا آهن.
وڌيڪ نمايان ڪرڻ لاءِ amyloid-like speckles/aggregates جي طبيعت، اسان 24 ڪلاڪن تائين غير داغ ٿيل ڪوسرويٽ نمونن کي (1 M) NaCl جي اعلي ڪنسنٽريشن سان علاج ڪيو، جنهن جي نتيجي ۾ پروٽين ڪوسرويٽس کان مجموعن کي جدا ڪيو ويو.جڏهن ائٽمي قوت مائڪرو اسڪوپي (AFM) استعمال ڪندي الڳ ٿيل مجموعن (يعني مجموعن جو هڪ منتشر حل) ڏٺو ويو، اسان هڪ خاص طور تي گولي واري مورفولوجي جو مشاهدو ڪيو جنهن جي باقاعده اوچائي تقريبن 15 nm آهي، جيڪا وڌيڪ لوڻ جي ڪنسنٽريشن جي حالتن ۾ ملندڙ جلندڙ هوندي آهي. مٿاڇري تي مضبوط هائيڊروفوبڪ اثر جي ڪري عام امائلوڊ فائبرز جو رويو (نوٽ ڪريو ته فائبرن جي اوچائي عام طور تي ~ 10 nm هوندي آهي) (ضمني شڪل 10a).دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، جڏهن الڳ ٿيل مجموعن کي ThT سان گڏ هڪ معياري ThT فلوروسينس پرس ۾ لڳايو ويو، اسان ThT فلوروسينس مقدار جي پيداوار ۾ هڪ ڊرامائي واڌ جو مشاهدو ڪيو، ان جي مقابلي ۾ جڏهن ڊائي کي عام αS امائلائڊ فائبرز (Supplementary F10b) سان لڳايو ويو هو. coacervate aggregates تي مشتمل آهي amyloid-like structures..حقيقت ۾، مجموعا وڌيڪ لوڻ جي مقدار کي برداشت ڪرڻ وارا هئا پر 4 M guanidine chloride (GdnHCl) کي حساس، عام امائلائڊ فائبرز (ضمني شڪل 10c) وانگر.
اڳيون، اسان واحد ماليڪيول فلوروسينس استعمال ڪندي مجموعي جي ٺاھ جوڙ جو تجزيو ڪيو، مخصوص fluorescence correlation/cross-correlation spectroscopy (FCS/FCCS)، ۽ ٻن رنگن جي اتفاق جي سڃاڻپ (TCCD) جي برسٽ تجزيو.انهي جي پڇاڙيء ۾، اسان 100 μl LLPS نمونن ۾ 24 ڪلاڪن جي انڪوبيشن کانپوءِ ٺهيل مجموعي کي الڳ ڪيو جنهن ۾ αS ۽ Tau441 (ٻئي 25 μM) گڏ 1 μM AF488-ليبل ٿيل αS ۽ 1 μM Atto647N-ليبل ٿيل Tau441 شامل آهن.LLPS ۽ پروٽين جي وچ ۾ ڪنهن به ممڪن اليڪٽررو اسٽيٽيٽڪ رابطي کي روڪڻ لاءِ هڪ ئي PEG-free بفر ۽ 1 M NaCl (ساڳيو بفر coacervate کان مجموعن کي الڳ ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو) استعمال ڪندي نتيجي ۾ منتشر ٿيل مجموعي حل کي هڪ مونوموليڪولر اسٽيٽ ۾ گهٽايو.ھڪڙي ماليڪيول جي وقت جي رفتار جو ھڪڙو مثال تصوير 7a ۾ ڏسي سگھجي ٿو.FCCS/FCS تجزيا (ڪراس-رابطا، CC ۽ خودڪشي، AC) ڏيکاريا ويا ته αS ۽ tau تي مشتمل مجموعا نموني ۾ گهڻا هئا (ڏسو CC وکر ۾ تصوير. 7b، کاٻي پينل)، ۽ بقايا مونوميرڪ پروٽين جي اضافي طور تي ظاهر ٿيو. گھٽائڻ واري عمل جو نتيجو (ڏسو AC وکر شڪل 7b ۾، کاٻي پينل).صرف مونوميرڪ پروٽينن تي مشتمل نمونن کي استعمال ڪندي ساڳئي حل جي حالتن ۾ ڪنٽرول تجربا ڪيا ويا، سي سي وکر نه ڏيکاريا ويا، ۽ AC وکر هڪ-جزيو ڊفيوشن ماڊل (Eq. 4) سان چڱي طرح ٺهڪي اچي ٿو، جتي مونوميرڪ پروٽينن ۾ متوقع ڊفيوژن ڪوئفينٽس آهن (تصوير 7b) )، ساڄي پينل).مجموعي ذرڙن جي پکيڙ جي گنجائش 1 µm2/s کان گهٽ آهي، ۽ مونوميرڪ پروٽينن جو اٽڪل 1 µm2/s آهي.50-100 µm/s؛قدر ساڳيا حل جي حالتن هيٺ sonicated αS amyloid fibrils ۽ monomeric αS لاءِ اڳ ۾ شايع ٿيل قدرن سان ملندڙ جلندڙ آهن.جڏهن اسان TCCD ڌماڪي جي تجزيي (Fig. 7c، مٿين پينل) سان گڏ مجموعي جو تجزيو ڪيو، اسان ڏٺو ته هر الڳ ٿيل مجموعي ۾ (αS/Tau heteroaggregate)، اٽڪل 60٪ معلوم ٿيل مجموعي ۾ αS ۽ tau، اٽڪل 30٪ صرف شامل آهن. tau، اٽڪل 10٪ αS صرف.Stoichiometric analysis of αS/Tau heteroaggregates ظاھر ڪيو ويو آھي ته گھڻا heteroaggregates تاؤ (0.5 کان ھيٺ stoichiometry، سراسري تعداد ۾ tau molecules αS molecules کان 4 ڀيرا وڌيڪ آھي)، جيڪو اسان جي ڪم سان مطابقت رکي ٿو FLIM سيٽيو ۾. تجربا..FRET تجزيي مان ظاهر ٿيو ته انهن مجموعن ۾ ٻئي پروٽين شامل هئا، جيتوڻيڪ هن معاملي ۾ حقيقي FRET قدر وڏي اهميت نه رکندا آهن، ڇاڪاڻ ته هر مجموعي ۾ فلوروفورس جي ورڇ بي ترتيب هئي ڇاڪاڻ ته تجربي ۾ استعمال ٿيل غير ليبل ٿيل پروٽين جي اضافي سبب.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، جڏهن اسان ساڳئي تجزيي کي 45,46 بالغ amyloid مجموعن جي گھٽتائي واري Tau variant کي استعمال ڪيو (ڏسو ضمني تصوير. 11a,b)، اسان ڏٺو ته جيتوڻيڪ αS electrostatic مجموعو ساڳيو هو (ضمني تصوير. 11c، d)، coacervate جي اندر مجموعا ٺاهڻ جي صلاحيت انتهائي گھٽجي وئي ۽ FLIM سيٽيو تجربن ۾ ڪيترن ئي هنڌن کي ڳولي لڌو، ۽ ڪمزور ڪراس-رابطي وارو وکر الڳ ٿيل مجموعي نموني لاء ڏٺو ويو.جڏهن ته، معلوم ڪيل مجموعن جي ٿورڙي تعداد لاءِ (صرف Tau441 جو ڏهين حصو)، اسان ڏٺو ته هر مجموعي کي αS ۾ هن Tau variant جي ڀيٽ ۾ بهتر ڪيو ويو، تقريبن 50٪ دريافت ڪيل مجموعين ۾ صرف αS ماليڪيولن تي مشتمل آهي، ۽ αS اضافي ۾ متضاد هو. .مجموعا (ڏسو ضمني تصوير. 11e)، ان جي ابتڙ متفاوت مجموعا Tau441 (Fig. 6f).انهن تجربن جي نتيجن مان ظاهر ٿيو ته جيتوڻيڪ αS پاڻ coacervate جي اندر tau سان گڏ گڏ ڪرڻ جي قابل آهي، انهن حالتن ۾ tau nucleation وڌيڪ سازگار آهي، ۽ نتيجي ۾ پيدا ٿيندڙ amyloid-like aggregates αS ۽ tau جي صورت ۾ ڪم ڪرڻ جي قابل آهن.جڏهن ته، هڪ ڀيرو هڪ ٽائو-ريچ ڪور ٺهي ٿو، αS ۽ tau جي وچ ۾ heterotypic تعاملات، tau molecules جي وچ ۾ homotypic تعامل جي مجموعن ۾ پسند ڪيا ويندا آهن؛اسان مائع αS/tau coacervates ۾ پروٽين جا نيٽ ورڪ پڻ مشاهدو ڪندا آهيون.
αS/Tau441 electrostatic coacervates ۾ ٺهيل الڳ ٿيل مجموعن جي واحد ماليڪيولز جو هڪ نمائندو فلوروسينس عارضي نشان.αS/Tau441 coaggregates سان لاڳاپيل دفن (ظاهر ڪيل حد کان مٿي دفن) ٽن چڪاس چينلن ۾ مشاهدو ڪيو ويو (AF488 ۽ Atto647N اخراج سڌي جوش کان پوءِ، نيري ۽ ڳاڙهي لائينون، Atto647N اخراج اڻ سڌي جوش کان پوءِ)، FRET، وايوليٽ لائن).LLPS (کاٻي پينل) مان حاصل ڪيل الڳ ٿيل αS/Tau441 مجموعن جي نموني جو B FCS/FCCS تجزيو.AF488 ۽ Atto647N لاءِ آٽو correlation (AC) وکر نيري ۽ ڳاڙهي رنگن ۾ ڏيکاريا ويا آهن، ۽ ٻنهي رنگن تي مشتمل مجموعي سان لاڳاپيل ڪراس-رابطا (CC) وکر جامني رنگ ۾ ڏيکاريا ويا آهن.AC وکر ليبل ٿيل monomeric ۽ مجموعي پروٽين جي نسلن جي موجودگي کي ظاهر ڪن ٿا، جڏهن ته CC وکر صرف ڊبل-ليبل ٿيل مجموعي جي پکيڙ کي ڏيکاري ٿو.ساڳيو تجزيو، پر ساڳئي حل جي حالتن جي تحت الڳ ٿيل جڳهن ۾، نمونن تي مشتمل صرف monomeric αS ۽ Tau441 ساڄي پينل ۾ ڪنٽرول طور ڏيکاريا ويا آهن.c αS/Tau441 electrostatic coacervates ۾ ٺهيل الڳ ٿيل مجموعن جي واحد ماليڪيولز جو فلورسنس فليش تجزيو.معلومات هر مجموعي لاءِ چار مختلف ورهاڱي ۾ مليل آهي (N = 152) انهن جي اسٽوچيوميٽري، S قدر، ۽ FRET ڪارڪردگي جي خلاف سازش ڪئي وئي آهي (مٿين پينل، رنگ بار ظاهر ٿئي ٿو واقعا).ٽن قسمن جي مجموعن ۾ فرق ڪري سگهجي ٿو: -αS-صرف مجموعا S~1 ۽ FRET~0 سان، Tau-صرف مجموعا S~0 ۽ FRET~1 سان، ۽ heterogeneous Tau/αS مجموعا وچولي S سان گڏ ۽ FRET رقم جا تخمينو. ٻنهي مارڪر پروٽينن مان هر هڪ heterogeneous مجموعي (N = 100) ۾ ڳوليا ويا آهن هيٺين پينل ۾ ڏيکاريا ويا آهن (رنگ پيماني تي ظاهر ٿئي ٿو).خام ڊيٽا خام ڊيٽا فائلن جي صورت ۾ مهيا ڪيل آهن.
مائع پروٽين جي پختگي يا عمر وقت سان گڏ جيل جھڙي يا مضبوط ڍانچي ۾ ٿلهي ٿيڻ کي ٻڌايو ويو آهي ته ڪنڊينسيٽ 47 جي ڪيترن ئي جسماني ڪمن ۾ ملوث هجڻ سان گڏ بيماري ۾، هڪ غير معمولي عمل جي طور تي امائلائڊ مجموعي 7، 48، 49. هتي. اسان تفصيل سان مرحلن جي جدائي ۽ رويي جو مطالعو ڪندا آهيون.LSPT αS هڪ ڪنٽرول ٿيل ماحول ۾ بي ترتيب پوليڪيشنز جي موجودگي ۾ گهٽ مائڪرومولر ڪنسنٽريشن ۽ جسماني طور تي لاڳاپيل حالتن ۾ (ياد رهي ته αS جي جسماني ڪنسنٽريشن>1 µM50 آهي)، LPS جي عام thermodynamically هلائيندڙ رويي جي پٺيان.اسان ڏٺو ته αS، جنهن ۾ فزيولوجيڪل پي ايڇ تي انتهائي منفي چارج ٿيل سي-ٽرمينل علائقو شامل آهي، ايل ايل پي ايس ذريعي آبي محلول ۾ پروٽين سان مالا مال بوند ٺاھڻ جي قابل آهي، ان جي موجودگي ۾ انتهائي ڪيشنڪ ڊسڊڊڊ پيپٽائيڊس جهڙوڪ pLK يا Tau electrostatic جي عمل ذريعي. مجموعا macromolecules جي موجودگي ۾ پيچيده condensation.اهو عمل شايد سيلولر ماحول ۾ لاڳاپيل اثر رکي ٿو جتي αS ان جي بيماري سان لاڳاپيل مجموعن سان لاڳاپيل مختلف پوليڪيشنڪ ماليڪيولن کي منهن ڏئي ٿو، ٻنهي ۾ ويٽرو ۽ وييو 51,52,53,54 ۾.
ڪيترين ئي مطالعي ۾، بوندن جي اندر پروٽين جي ڊينامڪس کي سمجھيو ويو آهي اهم عنصرن مان هڪ جو تعين ڪرڻ واري عمل 55,56.electrostatic αS ۾ پوليڪيشنز سان هم آهنگ ٿئي ٿو، پختگي جو عمل ظاهري طور تي انحصار ڪري ٿو پوليڪيشنز سان رابطي جي طاقت، ويلنس، ۽ انهن ڳالهين جي ضرب تي.Equilibrium Theory مان معلوم ٿئي ٿو ته ٻن مائع رياستن جو هڪ متوازن نظارو بائيو پوليمر سان مالا مال هڪ وڏي قطري جي موجودگي هوندو جيڪو LLPS57,58 کي هلائي ٿو.اوسٽوالڊ ميٽوريشن 59، ڪوئلسنس 60 يا منتشر فيز 61 ۾ مفت مونومر جي استعمال ذريعي قطرن جي واڌ حاصل ڪري سگهجي ٿي.αS ۽ Tau441، ΔNt-Tau يا pLK لاء، گهڻو ڪري پروٽين هن مطالعي ۾ استعمال ڪيل حالتن جي تحت ڪنڊينٽ ۾ مرڪوز ڪيو ويو.جڏهن ته، مڪمل سائيز ٽائو بوند تيزيءَ سان گڏ ٿي ويا مٿاڇري جي ٿلهي تي، قطرن جو گڏيل ۽ گندو ΔNt-Tau ۽ pLK لاءِ مشڪل هو، انهن ٻن سسٽمن ۾ مائع ملڪيتن جي تيزيءَ سان نقصان جو مشورو ڏئي ٿو.اسان جي FLIM-FRET تجزيي جي مطابق، عمر وارا pLK ۽ ΔNt-Tau بوند ڏيکاريا ساڳيا درجي جي پروٽين جي مجموعي (ساڳئي fluorescence لائف ٽائيم) اصل بوندن وانگر، اهو مشورو ڏئي ٿو ته اصل پروٽين نيٽورڪ برقرار رکيو ويو، جيتوڻيڪ وڌيڪ سخت.
اسان پنھنجي تجرباتي نتيجن کي ھيٺ ڏنل ماڊل ۾ منطقي بڻايون ٿا (شڪل 8).شروعاتي طور تي عارضي طور تي ٺهيل قطرا اڪثر ڪري پروٽين جا نيٽ ورڪ هوندا آهن بغير ڪنهن اليڪٽررو اسٽيٽيڪڪ معاوضي جي، ۽ اهڙيءَ طرح چارج عدم توازن جا علائقا آهن، خاص طور تي قطرن جي انٽرفيس تي، جنهن جي نتيجي ۾ بوندن کي اعلي اليڪٽررو اسٽيٽڪ مٿاڇري جي صلاحيت سان.چارج جي معاوضي لاءِ (هڪ رجحان جنهن کي عام طور تي ويلنس ڊيپليشن چيو ويندو آهي) ۽ بوندن جي سطحي صلاحيت کي گھٽائڻ لاءِ، بوندن ۾ شامل ٿي سگهن ٿا نئين پوليپيپٽائيڊس کي ڊائلٽ مرحلي مان، پروٽين نيٽ ورڪ کي ٻيهر منظم ڪرڻ لاءِ چارج-چارج رابطي کي بهتر ڪرڻ لاءِ، ۽ ٻين بوندن سان رابطو.سطحن سان گڏ (گلا ڪرڻ).αS/pLK بوند، انهن جي سادي پروٽين نيٽ ورڪ جي ڪري (صرف αS ۽ pLK جي وچ ۾ heterotypic تعامل) ۽ پروٽين-پروٽين جي رابطي لاءِ وڌيڪ لاڳاپو، لڳي ٿو ته ڪنڊينسيٽ جي چارج کي وڌيڪ تيزيءَ سان توازن ڪرڻ جي قابل ٿي وڃن ٿا؛درحقيقت، اسان شروعاتي طور تي ٺهيل αS/pLK coacervates ۾ αS/Tau جي ڀيٽ ۾ تيز پروٽين جي ڪينيٽيڪس کي ڏٺو.وولنس جي گھٽتائي کان پوءِ، تعاملات گهٽ وقتي ٿي ويندا آهن ۽ قطرا پنهنجي مائع خاصيتن کي وڃائي ڇڏيندا آهن ۽ جيل جهڙو، غير ٻرندڙ بوندن ۾ تبديل ٿي ويندا آهن جن سان گهٽ برقي سطح جي صلاحيت (۽ ان ڪري مٿاڇري کي گلي ڪرڻ جي قابل ناهي).ان جي ابتڙ، αS/Tau droplets وڌيڪ پيچيده پروٽين نيٽ ورڪن جي ڪري (ٻنهي homotypic ۽ heterotypic interactions) ۽ پروٽين جي رابطي جي ڪمزور طبيعت جي ڪري قطرن جي چارج بيلنس کي بهتر ڪرڻ ۾ گهٽ ڪارگر آهن.اهو نتيجو بوندن ۾ پيدا ٿئي ٿو جيڪي وڌايل عرصي تائين مائع جي رويي کي برقرار رکندا آهن ۽ هڪ اعلي اليڪٽرروسٽيٽڪ سطح جي صلاحيت کي ظاهر ڪن ٿا جيڪي گهٽجڻ ۽ وڌڻ سان گهٽجي ويندا آهن (اهڙيءَ طرح قطرن جي سطح جي ايراضي/حجم تناسب کي گھٽائڻ) ۽ هائيڊروفيلڪ مٿاڇري جي ڪيم کي ويٽ ڪندي.هي وڏيون مرڪوز پروٽين لئبرريون ٺاهي ٿو جيڪي مائع جي خاصيتن کي برقرار رکندا آهن جيئن پروٽين نيٽ ورڪ ۾ چارج اصلاح جي مسلسل ڳولا جي ڪري تعامل تمام عارضي رهن ٿا.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، N-اصطلاحي طور تي ٽوڙيل ٽائو جون شڪليون، جن ۾ ڪجهه قدرتي طور تي موجود isoforms62 شامل آهن، وچولي رويي جي نمائش ڪن ٿا، ڪجهه coacervates αS سان گڏ ڊگھي ڄمار جيل جھڙي بوندن ۾ تبديل ٿي وڃن ٿا، جڏهن ته ٻيا وڏا مائع ڪنڊينيٽس ۾ تبديل ٿين ٿا.αS electrostatic coacervates جي پختگي ۾ هي دوئي تازو LLPS نظرياتي ۽ تجرباتي مطالعي سان مطابقت رکي ٿو، جن کي ڪنڊينسيٽس ۾ ويلنس جي گھٽتائي ۽ اليڪٽرروسٽيٽڪ سيونگ جي وچ ۾ رابطي جي سڃاڻپ ڪئي وئي آهي ته ڪنڊينٽ سائيز ۽ سيال جي ملڪيت کي ڪنٽرول ڪرڻ جي ڪنجي طور.ميڪانيزم 58.61.
هي اسڪيم αS ۽ Tau441 لاءِ LLPS ۽ LSPT ذريعي پوٽيٽيو ايميلوڊ ايگريگيشن رستو ڏيکاري ٿو.اضافي anion-rich (red) ۽ cation-rich (blue) علائقن سان، αS ۽ tau electrostatic coacervates اطمينان بخش ويلنس سان گڏ مٿاڇري جي گھٽ توانائي آهي ۽ ان ڪري گهٽ هڪجهڙائي آهي، جنهن جي نتيجي ۾ تيز بوندن جي عمر وڌي ٿي.هڪ مستحڪم غير جمع ٿيل جيل رياست حاصل ڪئي وئي آهي..اها صورتحال تمام گهڻي سازگار آهي αS/pLK سسٽم جي صورت ۾ ان جي اعلي لاڳاپي ۽ آسان پروٽين-جوڙي رابطي واري نيٽ ورڪ جي ڪري، جيڪا تيز جيل وانگر منتقلي جي اجازت ڏئي ٿي.ان جي برعڪس، غير اطمينان بخش valence سان قطرا ۽ ان ڪري، رابطي لاءِ موجود پروٽين-چارج ٿيل علائقا، coacervate لاءِ هائيڊروفيلڪ مٿاڇري کي فيوز ۽ ويٽ ڪرڻ آسان بڻائين ٿا ته جيئن ان جي اعلي سطحي توانائي کي گھٽائي سگهجي.اها صورتحال αS/Tau441 coacervates لاءِ بهتر آهي، جن وٽ هڪ ملٽي وييلنٽ پيچيده نيٽورڪ آهي جنهن ۾ ڪمزور Tau-Tau ۽ αS-Tau رابطي تي مشتمل آهي.موڙ ۾، وڏيون coacervates وڌيڪ آساني سان انهن جي سيال جهڙي ملڪيت کي برقرار رکندو، ٻين پروٽين کان پروٽين جي وچ ۾ رابطي جي اجازت ڏئي ٿي.بالاخر، amyloid heterogeneous aggregates جنهن ۾ ٻنهي αS ۽ tau فارم شامل آهن coacervate fluid جي اندر، جن جو تعلق ٿي سگهي ٿو انهن سان ملندڙ جسمن ۾، جيڪي neurodegenerative بيمارين جا نشان آهن.
αS/Tau441 جي پختگي دوران ٺھيل وڏي رطوبت جھڙي اڏاوت ھڪ تمام گھڻي ڀريل پر متحرڪ پروٽين واري ماحول سان ۽، ٿوري حد تائين، αS/ΔNt-Tau coacervates پروٽين جي مجموعي جي نيوڪليشن لاءِ مثالي ذخيرا آھن.اسان حقيقت ۾ هن قسم جي پروٽين ڪوسرويٽس ۾ مضبوط پروٽين جي مجموعي جي ٺهڻ جو مشاهدو ڪيو آهي، اڪثر ڪري ٻنهي αS ۽ tau تي مشتمل آهي.اسان اهو ڏيکاريو آهي ته هي هيٽرو ايگريگيٽس غير اليڪٽرروسٽٽيڪڪ رابطي جي ذريعي مستحڪم آهن، امائلوڊ مخصوص ThT رنگن کي پابند ڪرڻ جي قابل آهن ساڳئي طريقي سان عام امائلوڊ فائبرز، ۽ حقيقت ۾ مختلف اثرن جي ساڳئي مزاحمت آهي.ايل ايل پي ايس پاران ٺاهيل αS/tau مجموعن کي ڏيکاريو ويو آهي ته امائلائڊ جهڙوڪ ملڪيت آهن.درحقيقت، amyloid aggregation ۾ Tau جي گھٽتائي جي پختگي واري قسم خاص طور تي مائع اليڪٽرروسٽيٽڪ ڪوسرويٽ جي اندر هيٽروجنيئس αS مجموعن جي ٺهڻ ۾ خراب ٿي وئي آهي.αS/Tau441 مجموعن جي ٺهڻ جو مشاهدو صرف coacervates جي اندر ڪيو ويو، جيڪو مائع جھڙي خاصيتن کي برقرار رکندو هو، ۽ ڪڏهن به نه، جيڪڏهن coacervates / droplets جيل اسٽيٽ تائين نه پهچي ها.پوئين صورت ۾، electrostatic رابطي جي وڌندڙ طاقت ۽ نتيجي طور، پروٽين جي نيٽ ورڪ جي سختي پروٽينن جي ضروري ترتيب واري ترتيب کي روڪيو وڃي ٿو ته نئين پروٽين جي رابطي کي قائم ڪرڻ لاء امائلوڊ نيوڪليشن لاء ضروري آهي.بهرحال، اهو حاصل ڪري سگهجي ٿو وڌيڪ لچڪدار، مائع جهڙو ڪوسرويٽس، جنهن جي نتيجي ۾ مائع رهڻ جو امڪان آهي جيئن اهي سائيز ۾ وڌندا آهن.
حقيقت اها آهي ته ٺهڪندڙ مرحلن جي اندر مجموعن جي ٺهڻ وڏي αS/Tau ڪنڊينيٽس ۾ ترجيح هوندي آهي ننڍڙن بوندن جي ڀيٽ ۾ جيڪي تيزيءَ سان جيل ڪن ٿا، انهن عنصرن کي سڃاڻڻ جي لاڳاپي کي نمايان ڪري ٿو جيڪي قطرن جي گڏ ٿيڻ کي ڪنٽرول ڪن ٿا.اهڙيءَ طرح، نه رڳو مرحليوار علحدگيءَ جو رجحان آهي، پر ڪنڊينسيٽ جي سائيز کي به صحيح ڪم ڪرڻ ۽ بيماريءَ کان بچاءَ لاءِ ڪنٽرول ڪرڻ لازمي آهي.58,61.اسان جا نتيجا αS/Tau سسٽم لاءِ LLPS ۽ LSPT جي وچ ۾ توازن جي اهميت کي پڻ اجاگر ڪن ٿا.جڏهن ته قطرن جو ٺهڻ امڪانيلوائيڊ ايگريگريشن جي خلاف حفاظت ڪري سگهي ٿو پروٽين جي مونومر جي مقدار کي گهٽائڻ سان سنترپت جي حالتن ۾، جيئن ته ٻين سسٽم ۾ تجويز ڪيو ويو آهي 63,64، بوندن جي فيوزن جي اعلي سطح تي ٻوٽي جي فيوزن کي سست ترتيب واري ترتيب جي ذريعي اندروني پروٽين جي مجموعي کي وڌائي سگھي ٿي.پروٽين نيٽ ورڪ..
مجموعي طور تي، اسان جي ڊيٽا مضبوط طور تي زور ڀريو آهي مطابقت واري ويلنس جي مطابقت ۽ LSPT جي حوالي سان ڊراپ نيٽ ورڪ ۾ مطمئن / غير مطمئن رابطي.خاص طور تي، اسان ڏيکاريون ٿا ته مڪمل ڊگھائي αS/Tau441 ڪنڊينيٽس موثر طريقي سان فيوز ڪرڻ جي قابل آهن ۽ نيوڪليٽ ٺاهڻ لاءِ amyloid-like heteroaggregates جنهن ۾ ٻئي پروٽين شامل آهن ۽ اسان جي تجرباتي نتيجن جي بنياد تي هڪ ماليڪيولر ميکانيزم پيش ڪن ٿا.αS/Tau fluid coacervate ۾ ٻن پروٽينن جو گڏيل مجموعو جنهن کي اسان هتي رپورٽ ڪريون ٿا، شايد حقيقت ۾ شامل ٿيڻ ۾ ٻن پروٽينن جي گڏيل لوڪلائيزيشن سان لاڳاپيل هجي، جيڪي بيماري جا نشان آهن، ۽ LLPS ۽ LLPS جي وچ ۾ تعلق کي سمجهڻ ۾ مدد ڪري سگھن ٿا. amyloid aggregation، neurodegeneration ۾ انتهائي چارج ٿيل IDP لاءِ رستو هموار ڪري ٿو.
Monomeric WT-αS، cysteine ​​mutants (Q24C-αS، N122C-αS) ۽ ΔCt-αS variants (Δ101-140) E. coli ۾ ظاهر ڪيا ويا ۽ صاف ڪيا ويا جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آھي.5 ايم ايم ڊي ٽي ٽي شامل ڪيو ويو سڀني مرحلن ۾ αS cysteine ​​mutants جي صفائي ۾ ڊسلفائيڊ بانڊ ٺهڻ کي روڪڻ لاء.Tau441 isoform (پلاسميڊ حاصل ڪيل ايڊجين #16316 مان)، ΔNt-Tau variant (Δ1-150، حاصل ڪيل IVA کي پرائمر سان ڪلوننگ ڪندي CTTTAAGAAGGAGAGATACATGATCGCCCACCGCGG، CATATGTATCCTCTCTTCTTAAAGTTAA53-variant) GGCTC5 پرائمر سان) E. coli ڪلچر هئا OD600 = 0.6–0.7 تائين 37 ° C ۽ 180 rpm تي وڌيو ويو، ۽ ايڪسپريشن IPTG سان 3 ڪلاڪن لاءِ 37 ° C تي وڌايو ويو.سيلن کي 11,500 xg تي 15 منٽ لاءِ 4 °C تي ڌوئو ۽ 150 mM NaCl تي مشتمل لوڻ واري بفر سان ڌوئو.lysis بفر ۾ پيلٽ کي ٻيهر بحال ڪريو (20 ml في 1 L LB: MES 20 mM، pH 6.8، NaCl 500 mM، EDTA 1 mM، MgCl2 0.2 mM، DTT 5 mM، PMSF 1 mM، benzamidine 50μpepinM1mM).سونيڪيشن قدم برف تي 80٪ جي طول و عرض سان 10 دالن لاءِ ڪيو ويو (1 منٽ آن، 1 منٽ بند).هڪ الٽراسائونڊ ۾ 60 ml کان وڌيڪ نه ڪريو.E. coli lysates کي 95 ° C. تي 20 منٽن لاءِ گرم ڪيو ويو، پوءِ برف تي ٿڌو ڪيو ويو ۽ 40 منٽن لاءِ 127,000×g تي سينٽرفيوز ڪيو ويو.واضح ڪيل سپرنٽنٽ هڪ 3.5 kDa جھلي تي لاڳو ڪيو ويو (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) ۽ 4 L جي ڊائليسس بفر (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl, DM2 m2 mM) جي خلاف ڊائل ڪيو ويو. ، PMSF 0.1 ايم ايم) 10 ڪلاڪ لاء.هڪ 5 ml ڪيشن ايڪسچينج ڪالمن (HiTrap SPFF، Cytiva، MA، USA) توازن بفر سان گڏ ڪيو ويو (20 mM MES، pH 6.8، 50 mM NaCl، 1 mM EDTA، 2 mM MgCl2، 2 mM DTT، PFMS).tau lysate 0.22 μm PVDF فلٽر ذريعي فلٽر ڪيو ويو ۽ 1 ml / منٽ جي وهڪري جي شرح تي ڪالمن ۾ داخل ڪيو ويو.ايليوشن کي بتدريج ڪيو ويو، تاؤ کي 15-30٪ ايليوشن بفر (20 mM MES، pH 6.8، 1 M NaCl، 1 mM EDTA، 2 mM MgCl2، 2 mM DTT، 0.1 mM PMSF) سان لڳايو ويو.جزن جو تجزيو SDS-PAGE ذريعي ڪيو ويو، ۽ ڪنهن به جزن تي مشتمل هڪ بئنڊ جنهن ۾ ٽائو جي متوقع ماليڪيولر وزن سان 10 kDa سينٽرفيوج فلٽر استعمال ڪندي مرڪوز ڪيو ويو ۽ هڪ بفر سان تبديل ڪيو ويو جنهن ۾ 10 mM HEPES، pH 7.4، NaCl 500 mM ۽ DTT mM لاءِ آخري پروٽين جي ڪنسنٽريشن 100 μM هئي.ان کان پوء پروٽين جو حل 0.22 μm PVDF فلٽر ذريعي گذريو ويو، جلدي منجمد ڪيو ويو ۽ محفوظ ڪيو ويو -80 ° C.پروٽين K18 مھرباني ڪري پروفيسر البرٽو بوفي پاران مهيا ڪيل آھي.تياري جي پاڪائي 95% هئي جيئن تصديق ٿيل SDS-PAGE ۽ MALDI-TOF/TOF.مختلف سيسٽين کي ڪيميائي طور تي AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) يا TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada) سان ليبل ڪيو ويو.جذب ۽ MALDI-TOF/TOF پاران تصديق ڪئي وئي.Tau441، ΔNt-Tau، AggDef-Tau ۽ K18 ساڳئي طريقي جي پٺيان Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH، Siegen، Germany) استعمال ڪندي پوزيشن 191 ۽ 322 تي مقامي سيسٽين جي رهائشن سان ليبل ڪيا ويا.αS ۽ Tau441 لاءِ خالص چارج في رهائشي نقشا CIDER66 استعمال ڪندي ٺاهيا ويا.
سولڊ پولي-ايل-لائسين (pLK DP 90-110 NMR موجب NMR from supplier, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) 10 mM HEPES، 100 mM NaCl، pH 7.4 کان 10 mM ڪنسنٽريشن ۾ حل ڪيو ويو، پروسيس لاءِ سونيڪ ٿيل الٽراسونڪ پاڻي جي غسل ۾ منٽ ۽ -20 ° C تي ذخيرو ڪريو.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) ۽ FITC-dextran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) پاڻي ۾ حليل ۽ وڏي پيماني تي LLPS بفر ۾ ورهايل آھن.ڊائليسس آلوده لوڻ کي ختم ڪري ٿو.انهن کي پوءِ سرنج فلٽر ذريعي فلٽر ڪيو ويو 0.22 μm جي پوئر سائيز سان، ۽ انهن جي ڪنسنٽريشن کي ريفريڪٽوميٽر (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA) استعمال ڪندي حساب ڪيو ويو.ايل ايل پي ايس جا نمونا هيٺين ترتيب ۾ ڪمري جي حرارت تي تيار ڪيا ويا: بفر ۽ اخراج کي ملايو ويو ۽ 1 ايم ايم ٽريس (2-ڪاربوڪسيٿيل) فاسفين (TCEP، ڪاربوسنٿ، ڪمپٽن، برطانيه)، 1 ايم ايم 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-diyldinitrile) tetraacetic acid (EDTA, carboxynth) ۽ 1% protease inhibitor جو مرکب (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).پوءِ αS ۽ فيوز ٿيل پوليڪيشنز (آپشنز pLK يا Tau) شامل ڪيا ويا آھن.thioflavin-T ٽائيم سيريز تجربن لاءِ (ThT, Carbosynth, Compton, UK)، ڪل ThT ڪنسنٽريشن کي اڌ αS ڪنسنٽريشن استعمال ڪريو.نرميءَ سان پر چڱيءَ طرح سان نموني ملايو ته جيئن اهي هڪجهڙا هجن.هر جزو جي ڪنسنٽريشن مختلف تجربن کان تجربن تائين، جيئن نتيجن جي حصي ۾ بيان ڪيو ويو آهي.Azide استعمال ڪيو ويو 0.02٪ (w/v) جي ڪنسنٽريشن تي جڏهن به تجربي جي مدت 4 ڪلاڪن کان وڌي وئي.LLPS نموني استعمال ڪندي سڀني تجزين لاءِ، تجزيي کان پهريان 5 منٽن لاءِ مرکب کي برابر ڪرڻ جي اجازت ڏيو.روشني پکيڙڻ واري تجزيي لاءِ، 150 µl نمونا غير پابند ٿيل 96-ويل مائڪرو پليٽس تي لوڊ ڪيا ويا (µClear®, black, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) ۽ چپڪندڙ فلم سان ڍڪيل.CLARIOstar پليٽ ريڊر (BMG Labtech، Ortenberg، Germany) ۾ حل جي مرڪز تي 350 nm تي جذب کي ماپڻ سان LLPs جي نگراني ڪئي وئي.تجربا 25 ° C تي ٽي ڀيرا ڪيا ويا، ۽ غلطين جي حساب سان معياري انحراف جي حساب سان ڪيو ويو.ٿلهي مرحلي کي نموني سينٽرفيوگريشن ۽ SDS-PAGE جيل جي تجزيي جي ذريعي مقدار ۾ ڪيو ويو، ۽ αS ڀاڱي ۾ ٿلهي ۽ مرڪوز مرحلن کي مختلف LLPS حلن ۾ مقدار ۾ ڪيو ويو.هڪ 100 μl LLPS جو نمونو جنهن ۾ 1 μM AF488-ليبل ٿيل αS شامل آهي مڪمل ميلاپ ذريعي تيار ڪيو ويو ۽ بعد ۾ سينٽرفيوگريشن 9600×g تي 30 منٽن لاءِ، جنهن کان پوءِ عام طور تي ترڪيب نظر ايندو هو.SDS-PAGE gel استعمال ڪندي پروٽين جي مقدار جي لاءِ سپرنٽنٽ جي مٿين 50 μl استعمال ڪئي وئي.جيل کي AF488 فلٽر سان اسڪين ڪيو ويو ChemiDoc جيل اميجنگ سسٽم (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) استعمال ڪندي يا Coomassie جي داغ سان داغ ٿيل ۽ مناسب فلٽرن سان بصري ڪيو ويو.نتيجي ۾ بينڊ جو تجزيو ڪيو ويو ImageJ ورجن 1.53i (نيشنل انسٽيٽيوٽ آف هيلٿ، يو ايس اي) استعمال ڪندي.تجربا هڪجهڙا نتيجا سان گڏ ٻن مختلف تجربن ۾ نقل ڪيا ويا.
عام طور تي، نموني جا 150 μl غير بائنڊنگ 96-سٺي مائڪروپليٽس تي لاڳو ڪيا ويا ۽ ڪمري جي حرارت تي لييڪا DMI6000B الٽي خوردبيني (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) تي ڏسڻ ۾ آيا.اسپاٽ تجربن لاءِ، µ-Slide Angiogenesis پليٽس (Ibidi GmbH، Gräfelfing، Germany) يا 96-well polystyrene microplates (Corning Costar Corp.، Acton، Massachusetts) پڻ استعمال ڪيا ويا.EL6000 هالوجن يا پارا ڌاتو هالائيڊ لیمپ روشنيءَ جي ذريعن طور استعمال ڪيا ويا (ترتيب BF/DIC ۽ WF اميجنگ لاءِ).WF microscopy لاءِ، 40x ميگنيفڪيشن ايئر مقصد (Leica Microsystems، Germany) استعمال ڪيو ويو ته جيئن روشني کي نموني تي ڌيان ڏيڻ ۽ ان کي گڏ ڪيو وڃي.AF488 ۽ ThT ليبل ٿيل نمونن لاءِ، فلٽر جوش ۽ اخراج معياري GFP فلٽر سيٽ سان، جوش ۽ اخراج بينڊ پاس فلٽر، ترتيب سان، 460-500 nm ۽ 512-542 nm بينڊ پاس فلٽر، ۽ هڪ 495 nm dichro.Atto647N سان ليبل ٿيل نمونن لاءِ، جوش ۽ اخراج بينڊ پاس فلٽر سان گڏ Cy5 فلٽرن جو هڪ معياري سيٽ 628-40 nm ۽ 692-40 nm، ترتيب سان، ۽ هڪ 660 nm ڊڪروڪ آئيني استعمال ڪيو ويو.BF ۽ DIC مائڪرو اسڪوپي لاءِ، ساڳيا عڪاسي ٿيل روشني گڏ ڪرڻ جو مقصد استعمال ڪريو.گڏ ڪيل روشني هڪ Leica DFC7000 CCD ڪئميرا (Leica Microsystems, Germany) تي رڪارڊ ڪئي وئي.نمائش جو وقت BF ۽ DIC مائڪرو اسڪوپي اميجنگ لاءِ 50 ms ۽ WF مائڪرو اسڪوپي اميجنگ لاءِ 20-100 ms هو.مقابلي لاءِ، ThT سان سڀني تجربن لاءِ نمائش جو وقت 100 ms هو.وقت گذرڻ جا تجربا بوندن جي گڏ ٿيڻ کي ڏسڻ لاءِ ڪيا ويا، تصويرن سان گڏ هر 100 ايم ايس تي ڪيترن ئي منٽن لاءِ.ImageJ (NIH، USA) تصوير جي تجزيو لاء استعمال ڪيو ويو.تجربا هڪجهڙائي جي نتيجن سان گڏ ٽي ڀيرا ڪيا ويا.
گڏيل تجربا، FRAP ۽ 3D بحالي لاءِ، تصويرون حاصل ڪيون ويون زيس LSM 880 inverted confocal microscope تي استعمال ڪندي ZEN 2 بليو ايڊيشن (ڪارل زيس اي، اوبرڪوچن، جرمني).50 µl جا نمونا µ-Slide Angiogenesis Petri dishes (Ibidi GmbH، Gröfelfing، جرمني) تي لاڳو ڪيا ويا، هڪ هائيڊروفيلڪ پوليمر (ibiTreat) سان علاج ڪيو ويو ۽ 63× تيل وسرڻ واري مقصد ۾ نصب ڪيو ويو (Plan-Apochromat 63/il NA×4) DIC تي).تصويرون 458 nm، 488 nm، ۽ 633 nm آرگن ليزر لائينون استعمال ڪندي 0.26 µm/pixel جي ريزوليوشن سان حاصل ڪيون ويون ۽ 470-600 nm، 6289-628nm، 628nm، 6289، 470-600 nm، 8 µs/pixel جو جوش ۽ اخراج معلوم ڪرڻ واري وقت لاءِ. ۽ 638-755 nm استعمال ڪيو ويو ThT، AF488 ۽ Atto647N، ترتيب ڏيڻ لاء.FRAP تجربن لاءِ، هر نموني جي وقت گذرڻ واري فوٽوگرافي 1 فريم في سيڪنڊ تي رڪارڊ ڪئي وئي.تجربا ساڳئي نتيجن سان گڏ ڪمري جي حرارت تي ٽن حصن ۾ ڪيا ويا.سڀني تصويرن جو تجزيو ڪيو ويو زين 2 بليو ايڊيشن سافٽ ويئر (ڪارل زيس اي جي، اوبرڪوچن، جرمني).FRAP وکر کي عام ڪيو ويو، پلاٽ ڪيو ويو ۽ شدت / وقت جي ڊيٽا کي لڳايو ويو جيڪي تصويرن مان ڪڍيا ويا زين 2 استعمال ڪندي OriginPro 9.1 استعمال ڪندي.وصولي واري وکر هڪ مونو-exponential ماڊل ۾ فٽ ڪيا ويا هئا ماليڪيولر ڊفيوژن جي حساب سان اضافي توسيع واري اصطلاح سان گڏ حاصل ڪرڻ واري بليچنگ اثر جي حساب سان.اسان پوءِ حساب ڪيو D استعمال ڪندي نامياري بليچنگ ريڊيس ۽ اڳ ۾ طئي ٿيل وصولي اڌ زندگي جيئن ڪانگ ايٽ ال جي مساوات ۾.5 35 ڏيکاريو ويو.
αS جي سنگل سيسٽين مختلف قسمن کي 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) سان 24 پوزيشن تي (TEMPOL-24-αS) ۽ 122 (TEMPOL-122-αS)، ترتيب سان.اسپين ليبلنگ EPR تجربن لاءِ، αS ڪنسنٽريشن 100 μM تي مقرر ڪيو ويو ۽ PEG ڪنسنٽريشن 15٪ (w/v) هو.مختلف مجموعي حالتن لاءِ، αS:pLK تناسب 1:10 هو، جڏهن ته αS:ΔNt-Tau ۽ αS:Tau441 تناسب 1:1 تي برقرار رکيو ويو.ڪثرت جي غير موجودگيءَ ۾ پابند ٽائيٽل تجربن لاءِ، TEMPOL-122-αS 50 μM تي برقرار رکيو ويو ۽ پوليڪيشنز کي وڌاءُ ڪنسنٽريشن تي ٽائيٽ ڪيو ويو، هر حالت کي الڳ الڳ تيار ڪندي.CW-EPR ماپون استعمال ڪيون ويون Bruker ELEXSYS E580 X-band spectrometer سان ليس هڪ Bruker ER4118 SPT-N1 ريزونيٽر سان جيڪو مائڪرو ويڪرو (SHF) فريڪوئنسي تي ڪم ڪري ٿو ~ 9.7 GHz.گرمي پد 25 ° C تي مقرر ڪيو ويو ۽ هڪ مائع نائٽروجن cryostat ذريعي ڪنٽرول ڪيو ويو.4 ميگاواٽ جي ميگاواٽ پاور، 0.1 ميگاواٽ جي ماڊل جي ماپ، ۽ 100 kHz جي ماڊل جي تعدد تي اسپيڪٽرا غير محفوظ ٿيل حالتن ۾ حاصل ڪيا ويا.تماشي جي شدت کي عام ڪيو ويو ته جيئن نمونن جي وچ ۾ اسپن ڪنسنٽريشن ۾ فرق کان بچڻ لاءِ ۽ ممڪن اسپن جي گھٽتائي جي ڪري نمونن ۾ گھٽتائي جي ايجنٽن جي بقايا مرڪزن جي ڪري جنهن ۾ Tau441 يا ΔNt-Tau (موجوده اصل پروٽين جي حلن ۾ موجود آهي).G جا ڏنل قدر حاصل ڪيا ويا EPR اسپيڪٽرل ماڊلنگ جي نتيجي ۾ Easyspin سافٽ ويئر استعمال ڪندي (v. 6.0.0-dev.34) Matlab®67 ۾ لاڳو ٿيل.ھڪڙي / ٻه جزو اسوٽروپڪ ماڊل ڊيٽا کي ماڊل ڪرڻ لاء استعمال ڪيا ويا.سڀني سگنلن کي عام ڪرڻ کان پوءِ، بقايا ڳڻيا ويا ھر سميوليشن کي لاڳاپيل تجرباتي اسپيڪٽرم مان گھٽائڻ سان.پابند ٽائيٽليشن جي تجزيي لاءِ، ٽئين بينڊ جي لاڳاپي واري شدت کي عام ٿيل EPR اسپيڪٽرم (IIII/III) جي ٻئي بينڊ کي αS تائين پوليڪيشن جي پابند جي نگراني ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو.علحدگيءَ واري مستقل (Kd) جو اندازو لڳائڻ لاءِ، نتيجي وارو وکر لڳ ڀڳ ماڊل تي لڳايو ويو، فرض ڪيو ويو ته n هڪجهڙائي ۽ آزاد بائنڊنگ سائيٽس.
NMR اسپيڪٽروڪوپي تجربا ڪيا ويا Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR اسپيڪٽروميٽر استعمال ڪندي هڪ cryoprobe ۽ Z-gradient سان ليس.سڀئي تجربا 130-207 µM αS استعمال ڪيا ويا ۽ 10 mM HEPES، 100 mM NaCl، 10% DO، pH 7.4 ۾ لاڳاپيل αS/ΔNt-Tau ۽ pLK برابري استعمال ڪيا ويا ۽ 15 ° C تي ڪيا ويا.NMR پاران LPS جي نگراني ڪرڻ لاء، 10٪ PEG اڳ ۾ مخلوط نموني ۾ شامل ڪيو ويو.ڪيميائي شفٽ perturbation پلاٽ (Fig. 1b) ڏيکاري ٿو سراسري 1H ۽ 15N ڪيميائي شفٽ.αS 2D1H-15N HSQC اسپيڪٽرا اڳوڻي تفويض (BMRB داخلا #25227) جي بنياد تي تفويض ڪيا ويا ۽ HNCA، HNCO ۽ CBCAcoNH جي 3D اسپيڪٽرا کي رڪارڊ ۽ تجزيو ڪندي تصديق ڪئي وئي.13Cα ۽ 13Cβ ڪيميائي شفٽون ΔNt-Tau يا pLK جي موجودگي ۾ ڳڻيا ويا ثانوي ڍانچي جي رجحانن ۾ ممڪن تبديلين کي ماپڻ لاءِ αS ڪيميائي شفٽن جي مقابلي ۾ خالص بي ترتيب ڪوئلي جي ٺاھ جوڙ 68 (ضمني شڪل 5c).R1ρ جي شرح 8، 36، 76، 100، 156، 250، 400، ۽ 800 ms جي دير سان hsqctretf3gpsi تجربن (بروڪر لائبريري مان حاصل ڪيل) رڪارڊ ڪندي ماپ ڪئي وئي، ۽ exponential افعال کي ترتيب ڏني وئي دير جي چوٽي تي مختلف وقتن تي. R1ρ ۽ ان جي تجرباتي غير يقيني صورتحال کي طئي ڪرڻ لاء وقت.
ٻن رنگن جي وقت-حل ٿيل فلوروسينس مائڪرو اسڪوپي تجربا تجارتي وقت-حل ٿيل MT200 فلوروسينس ڪنفوڪل مائڪرو اسڪوپ (PicoQuant، برلن، جرمني) تي وقت سان لاڳاپيل سنگل فوٽوون ڳڻپ (TCSPC) ڊوائيس سان ڪيا ويا.ليزر ڊيوڊ هيڊ استعمال ڪيو ويندو آهي pulsed interleaved excitation (PIE)، شعاع هڪ واحد موڊ ويو گائيڊ مان گذري ٿو ۽ 481 nm ۽ 637 nm ليزر لائينز لاءِ 10 کان 100 nW جي ليزر پاور تي ٽيون ڪيو ويو آهي جيڪي ڊيڪروڪ آئيني کان پوءِ ماپيل آهن.اهو هڪ بهترين فوٽوون ڳڻپ جي شرح کي يقيني بڻائي ٿو، فوٽون الياسنگ، فوٽو بليچنگ ۽ سنترپشن جي اثرن کان بچڻ.μ-Slide angiogenesis coverslips or plates (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) سڌي طرح وسرندڙ پاڻي ۾ رکيا ويا ھڪ سپر Apochromat 60x NA 1.2 لينس مٿان اصلاحي ڪالر سان (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).A 488/640 nm dichroic Mirror (Semrock, Lake Forest, IL, USA) استعمال ڪيو ويو مکيه بيم اسپلٽر طور.اڻ مرڪوز تابڪاري کي 50 مائڪرن جي قطر سان سوراخ ذريعي روڪيو ويندو آهي، پوءِ متمرکز تابڪاري کي 50/50 بيم اسپلٽر ذريعي 2 سڃاڻپ جي رستن ۾ ورهايو ويندو آهي.بينڊ پاس اخراج فلٽر (سيمروڪ، ڍنڍ ٻيلو، IL، USA) 520/35 سائي رنگ لاءِ (AF488) ۽ 690/70 لال رنگ لاءِ (Atto647N) ڊيڪٽر جي سامهون استعمال ڪيا ويا.سنگل-فوٽن برفاني ڊاءڊس (SPAD) (مائڪرو فوٽوون ڊيوائسز، بولزانو، اٽلي) ڊڪٽيٽر طور استعمال ڪيا ويا.ٻئي ڊيٽا گڏ ڪرڻ ۽ تجزيو ڪيو ويو تجارتي طور تي دستياب SymphoTime64 سافٽ ويئر (PicoQuant GmbH، Berlin، Germany).
ايل ايل پي ايس نموني جا 50 مائڪروليٽرز μ-Slide angiogenesis ويلز تي لاڳو ڪيا ويا (Ibidi GmbH، Gräfelfing، جرمني).نتيجي ۾ نڪرندڙ تصويرون 20 µm کان مٿي کوھ جي ھيٺان آھن، معطل ٿيل بوندن لاءِ بھترين مقصدي ڪم ڪرڻ واري مفاصلي لاءِ ~ 1 µm تائين ۽ رافٽس ۽ ڊاٽن لاءِ گھٽ ۾ گھٽ 0.25 µm/pixel جي محوري ريزوليوشن سان ۽ 400 µs/pixel جي دير واري وقت سان.هر چينل لاءِ سراسري پس منظر سگنل جي شدت (PBG، مطلب + 2σ) جي بنياد تي شدت واري حد کي لاڳو ڪندي ڊيٽا چونڊيو ته جيئن منتشر ٿيل مرحلي مان ڪنهن به ممڪن اصليت کي فلٽر ڪندي، صرف مائع پروٽين جا قطرا، رافٽس يا اسپاٽ چونڊيا وڃن.هر چينل جي هر نسل (τ) جي عمر جو تجزيو ڪرڻ لاءِ (سائي، “g” AF488 لاءِ ۽ ڳاڙهي، “r” Atto647N لاءِ)، اسان دلچسپيءَ جا علائقا (ROIs) چونڊيا آهن جن ۾ قطرا، رافٽس، يا اسپاٽ (ضمني شڪل 1) شامل آهن. ).8b) ۽ انهن کي هر چينل ۾ tail-fit analysis ۽ 2-component decay ماڊل استعمال ڪندي انهن جي حياتيءَ جي خرابي (τD، τR ۽ τP لاءِ بوندن، رافٽس يا اسپاٽس لاءِ ترتيبوار، ضمني شڪل 8c ڏسو) حاصل ڪيو.سراسري τ کان τ .ROIs جيڪي پيدا ڪيا ويا تمام ٿورڙا فوٽن لاءِ گھڻ-exponential fit تجزيي مان خارج ڪيا ويا.ڪٽ آف استعمال ڪيو ويو <104 فوٽن رافٽس ۽ ڊٽس لاءِ ۽ 103 قطرن لاءِ.بوندن جي حد گهٽ هوندي آهي ڇاڪاڻ ته وڌيڪ شدت واري قدرن سان سڙيل وکر حاصل ڪرڻ ڏکيو هوندو آهي، ڇاڪاڻ ته تصوير جي ميدان ۾ قطرا عام طور ننڍا ۽ گهٽ گهڻا هوندا آهن.ROIs فوٽوون ڳڻپ سان گڏ فوٽوون جمع ڪرڻ جي حد کان مٿي (سيٽ ڪيو ويو> 500 ڳڻپ/پيڪسيل) پڻ تجزيو لاءِ رد ڪيا ويا.دلچسپي واري علائقي مان حاصل ڪيل شدت واري زوال واري وکر کي وڌ ۾ وڌ 90٪ تي شدت سان ملايو (ٿوري زوال جي وڌ کان وڌ شدت کان ٿورو پوءِ) سروس لائف جي شروعات کان وٺي گهٽ ۾ گهٽ IRF مداخلت کي يقيني بڻائڻ لاءِ جڏهن ته سڀني شدت جي زوال لاءِ ساڳيو برقرار رکندي. سيٽنگون لاڳاپيل وقت ونڊو تجزيو ڪيو ويو 25 کان 50 ROI رافٽس ۽ اسپاٽس لاءِ ۽ 15-25 ROI قطرن لاءِ، تصويرون 4 کان وڌيڪ نقلن مان چونڊيل آهن جيڪي گهٽ ۾ گهٽ 3 آزاد تجربن مان رڪارڊ ڪيون ويون آهن.ٻن-ٽيل ٽي-ٽيسٽ استعمال ڪيا ويا آهن جنسون جي وچ ۾ شمارياتي اختلافن جو جائزو وٺڻ لاءِ يا coacervate سسٽم جي وچ ۾.زندگيءَ جي هڪ پکسل-جي-پڪسل تجزيي لاءِ (τ)، هر چينل لاءِ فيلڊ تي زندگيءَ جي ڪل ڪشش جو حساب ڪيو ويو ۽ 2/3-جزو جي توسيع واري اندازي واري ماڊل جو اندازو لڳايو ويو.هر پکسل لاءِ زندگيءَ جي تڪليف وري اڳ ۾ ڪيل τ قدرن کي استعمال ڪندي فٽ ڪئي وئي، نتيجي ۾ هڪ pseudocolor FLIM فٽ تصوير.tail-fit lifetime range هڪ ئي چينل جي سڀني تصويرن ۾ هڪجهڙائي هئي، ۽ هر ڊڪي هڪ قابل اعتماد فٽ مهيا ڪرڻ لاءِ ڪافي فوٽان پيدا ڪري ٿي.FRET تجزيي لاءِ، پکسلز کي 100 فوٽن جي گھٽ شدت واري حد کي لاڳو ڪرڻ سان چونڊيو ويو، جيڪو 11 فوٽن جي پس منظر سگنل (FBG) جي اوسط سان.هر چينل جي فلورسنس جي شدت تجرباتي طور تي طئي ٿيل اصلاحي عوامل طرفان درست ڪئي وئي: 69 اسپيڪٽرل ڪراسٽالڪ α 0.004 هو، سڌو جوش β 0.0305 هو، ڳولڻ جي ڪارڪردگي γ 0.517 هئي.پکسل جي سطح تي FRET ڪارڪردگي وري هيٺين مساوات کي استعمال ڪندي ڳڻيو ويندو آهي:
جتي FDD فلورسنس جي شدت آهي جيڪا ڊونر (گرين) چينل ۾ مشاهدو ڪئي وئي آهي، FDA اها فلوروسينس شدت آهي جيڪا قبول ڪندڙ (ڳاڙهي) چينل ۾ اڻ سڌي حوصلي هيٺ مشاهدو ڪئي وئي آهي، ۽ FAA اها فلوروسينس شدت آهي جيڪا قبول ڪندڙ (ڳاڙهي) چينل ۾ سڌي حوصلي هيٺ مشاهدو ڪئي وئي آهي ( PIE).چينل ۾ فلورسنس جي شدت واري دال جو مشاهدو ڪيو ويو آهي).
LLPS بفر ۾ 100 µl LLPS رد عمل جو حل جنهن ۾ 25 µM اڻ ليبل ٿيل مونوميرڪ Tau441 (25 µM αS سان يا بغير) LLPS بفر ۾ (مٿي ڏنل طور تي شامل ڪيو ويو) غير بائنڊنگ 96-اوائل مائڪرو پليٽس تي چپڪندڙ ورق جي ڪوٽنگ سان رکيل ۽ مائڪروپليٽ فارم ذريعي WF کان پوءِ چيڪ ڪيو ويو. توازن10 منٽ اندر.ڪمري جي حرارت تي 48 ڪلاڪن جي انڪيوبيشن کان پوء، پروٽين رافٽس ۽ اسپٽس جي موجودگي جي تصديق ڪئي وئي.پوءِ احتياط سان کوهه مان رافٽس جي مٿان مائع کي هٽايو، پوءِ 50 L dissociation buffer (10 mM HEPES، pH 7.4، 1 M NaCl، 1 mM DTT) شامل ڪريو ۽ 10 منٽ لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو.اعلي لوڻ جي ڪنسنٽريشن کي يقيني بڻائي ٿو ته LLPS بقايا PEG جي ڪري ورجائي نه سگھندا، ۽ ممڪن پروٽين اسيمبليون جيڪي صرف اليڪٽرروسٽٽيڪڪ رابطي جي ذريعي ٺھيل آھن جدا ڪيون وينديون.ان کان پوءِ کوهه جي تري کي احتياط سان مائڪروپيپيٽ ٽپ سان اسڪريپ ڪيو ويو ۽ نتيجو حل هڪ خالي مشاهدي واري کوهه ڏانهن منتقل ڪيو ويو.1 h لاءِ 50 μM ThT سان نموني جي انڪيوبيشن کان پوءِ، الڳ ٿيل جڳهن جي موجودگي کي WF مائڪرو اسڪوپي ذريعي چيڪ ڪيو ويو.PBS ۾ pH 7.4 سان 300 µl 70-µM αS محلول جي 300 µl، sodium azide 0.01% 37 °C تي ۽ 200 rpm کي 7 ڏينهن لاءِ آربيٽل شيڪر تي رکي سونيڪ ٿيل αS فائبرلز تيار ڪريو.ان کان پوءِ حل کي 30 منٽ لاءِ 9600×g تي سينٽرفيوج ڪيو ويو، گولي کي PBS pH 7.4 ۾ ٻيهر بحال ڪيو ويو ۽ سونيڪ ڪيو ويو (1 منٽ، 50٪ چڪر، 80٪ طول و عرض هڪ Vibra-سيل VC130 سونيڪٽر ۾، Sonics، Newton، USA) فيبريل نموني نسبتاً يونيفارم سائيز جي ورڇ سان ننڍي فائبر جي.
FCS/FCCS تجزيا ۽ ٻه-رنگ اتفاق جي سڃاڻپ (TCCD) ساڳئي MT200 وقت حل ٿيل فلورسنٽ ڪنفوڪل مائڪرو اسڪوپ (پيڪو-ڪانٽ، برلن، جرمني) تي ڪيا ويا جيڪي FLIM-FRET مائڪروسکوپي تجربن لاءِ استعمال ڪيا ويا PIE موڊ استعمال ڪندي.انهن تجربن لاءِ ليزر پاور شامل ڪئي وئي 6.0 µW (481 nm) ۽ 6.2 µW (637 nm).انهن ليزر قوتن جي ميلاپ کي چونڊيو ويو آهي ته جيئن استعمال ٿيل فلوروفورس جي جوڙن لاءِ ساڳي چمڪ پيدا ٿئي جڏهن ته بهترين ڳڻپ جي شرح حاصل ڪري ۽ فوٽو بليچنگ ۽ سنترپتي کان پاسو ڪري.ٻئي ڊيٽا گڏ ڪرڻ ۽ تجزيو ڪيو ويو تجارتي طور تي دستياب SymphoTime64 ورزن 2.3 سافٽ ويئر (PicoQuant، Berlin، Germany).
LLPS استعمال ڪندي حاصل ڪيل الڳ ٿيل αS/Tau مجموعن جا نمونا آئسوليشن بفر ۾ مناسب monomolecular ڪنسنٽريشن (عام طور تي هڪ 1:500 dilution، ڇاڪاڻ ته مجموعي طور تي اڳ ۾ ئي گهٽ ڪنسنٽريشن تي هوندا آهن جڏهن coacervate نموني کان ڌار ڪيو ويندو آهي).1 mg/mL جي ڪنسنٽريشن تي BSA حل سان پريڪيو ٿيل ڪپڙا (ڪارننگ، USA) تي سڌو سنئون نموني لاڳو ڪيا ويا.
سائي ۽ ڳاڙهي چينلن ۾ PIE-smFRET تجزيي لاءِ، 25 فوٽن جي گھٽ شدت واري حد کي لاڳو ڪيو ويو ته گهٽ شدت واري سگنلن کي فلٽر ڪرڻ لاءِ جيڪو مونوميرڪ واقعن جي ڪري پيدا ٿئي ٿو (ياد رهي ته مونومر الڳ ٿيل مجموعن جي مقابلي ۾ مجموعي نموني کان وڌيڪ آهن).ھن حد کي ڳڻيو ويو monomeric αS جي اوسط شدت جي پنج ڀيرا خالص مونومر نموني جي تجزيي مان حاصل ڪيل خاص طور تي تجزيو لاء مجموعن کي چونڊڻ لاء.PIE ڊرائيو سرڪٽ، TSCPC ڊيٽا جي حصول سان گڏ، هڪ لائف ٽائم ويٽنگ فلٽر جي ايپليڪيشن کي فعال ڪيو آهي جيڪو پس منظر ۽ اسپيڪٽرل ڪراسٽالڪ کي ختم ڪرڻ ۾ مدد ڪري ٿو.مٿين حدن کي استعمال ڪندي منتخب ٿيل ڀڄڻ جي شدت کي درست ڪيو ويو اوسط پس منظر سگنل استعمال ڪندي طئي ڪيو ويو هسٽوگرام جي واقعن جي شدت/بن جي مقابلي ۾ بفر-صرف نمونن جي.وڏي مجموعن سان جڙيل دفن عام طور تي وقت جي سراغ ۾ ڪيترن ئي لڳاتار بِن تي قبضو ڪندا آهن (1 ms تي مقرر).انهن حالتن ۾، وڌ ۾ وڌ طاقت جو هڪ بن چونڊيو ويو.FRET ۽ stoichiometric تجزيي لاء، نظرياتي طور تي طئي ٿيل گاما عنصر γ (0.517) استعمال ڪيو ويو.اسپيڪٽرل ڪراس اسٽالڪ ۽ سڌي حوصلا افزائي لاڳيتو استعمال ٿيل حوصلا افزائي ليزر پاور تي (تجرباتي طور تي طئي ٿيل) آهن.هڪ ڌماڪي ۾ FRET جي ڪارڪردگي ۽ اسٽوچيميٽري جو حساب هن ريت ڪيو ويو آهي.