347 اسٽينلیس سٹیل ڪوئلڊ ٽيوبنگ ڪيميائي جز، ناول انٽرفيرون جي سڃاڻپ ڪندڙ انساني ليوڪوائيٽ اينٽيجن-اي (HLA-A) ڪراس-لنڊڪ ماس اسپيڪٽروميٽري (CLMS) استعمال ڪندي چيپرون پروٽين

Nature.com گهمڻ لاءِ توهان جي مهرباني.توھان استعمال ڪري رھيا آھيو برائوزر ورزن محدود CSS سپورٽ سان.بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي بند ڪريو).اضافي طور تي، جاري مدد کي يقيني بڻائڻ لاء، اسان سائيٽ کي بغير اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ ڏيکاريون ٿا.
سلائڊر ڏيکاريندڙ ٽي مضمون في سلائڊ.سلائڊ ذريعي منتقل ڪرڻ لاء پوئتي ۽ ايندڙ بٽڻ استعمال ڪريو، يا هر سلائڊ ذريعي منتقل ڪرڻ لاء آخر ۾ سلائڊ ڪنٽرولر بٽڻ استعمال ڪريو.

پيداوار جي وضاحت

اسٽينلیس سٹیل 347L ڪوئل ٽيوب، اسٽيل گريڊ: SS347L

انٽرفيرون سگنلنگ سسٽم ماحول مان پيٿوجنڪ ۽ اندروني پيتھولوجيڪل سگنلن جي وسيع رينج لاءِ مضبوط سائٽوڪائن جي ردعمل کي جنم ڏئي ٿو، جنهن جي نتيجي ۾ انٽرفيرون-انڊيڪيبل پروٽينن جي سبسٽس کي شامل ڪيو وڃي ٿو.اسان لاڳو ڪيو DSS-ثالث ڪراس-لنڪ ماس اسپيڪٽروميٽري (CLMS) انٽرفيرون-حوصلہ افزائي پروٽين جي ڊومين ۾ نئين پروٽين-پروٽين جي رابطي کي ڳولڻ لاء.متوقع interferon-inducible پروٽينن جي اضافي ۾، اسان پڻ سڃاڻپ ڪئي ناول intermolecular ۽ intramolecular cross-linked addducts of canonical interferon-Inducible پروٽين جهڙوڪ MX1، USP18، OAS3، ۽ STAT1.اسان HLA-A پروٽينس (H2BFS-HLA-A-HMGA1) پاران ٺهيل هڪ ناول سيٽ جي interferon-Inducible پروٽين نيٽ ورڪ جي orthogonal validation تي ڌيان ڏنو ويو co-immunoprecipitation استعمال ڪندي ۽ انهن جي وڌيڪ مطالعي کي سالماتي متحرڪ ماڊلنگ استعمال ڪندي.پروٽين ڪمپليڪس جي تعميراتي متحرڪات جي ماڊلنگ ڪيترن ئي رابطي واري سائيٽن کي ظاهر ڪيو جيڪي CLMS جي نتيجن ۾ سڃاڻپ ٿيل رابطي کي ظاهر ڪن ٿا.گڏو گڏ، اسان CLMS جو هڪ پائلٽ مطالعو پيش ڪريون ٿا ته جيئن انٽرفيرون پاران پيدا ڪيل نئين سگنلنگ ڪمپليڪسز کي سڃاڻڻ لاءِ، ۽ CLMS جي وسيع استعمال جو انتظار ڪريون ته جيئن ٽومر مائڪرو ماحوليات ۾ پروٽين جي رابطي جي نئين متحرڪ کي سڃاڻڻ لاءِ.
ان کان اڳ جو هڪ موافقت وارو مدافعتي ردعمل شروع ٿئي، ميزبان جو فطري دفاعي نظام هڪ antimicrobial ردعمل کي ثالثي ڪري ٿو جيڪو secreted alpha-helical cytokines جي خاندان جي وچ ۾ آهي جنهن کي interferons (IFNs) سڏيو ويندو آهي.قسم I IFN ڪلاس IFNα ۽ IFNβ سيلولر جوابن کي چالو ڪري ٿو، بشمول اينٽي وائرل، پروپوپوٽوٽڪ، پروين فلاميٽري، ۽ اينٽي پروليفيريٽ رياستون.انسانن ۾، IFNα جا 13 ذيلي قسم سڃاتل آهن، جيڪي سڀ ڪروموزوم 91 تي ڪلسٽر ٿيل آهن. حيرت انگيز طور تي، صرف IFNα2 جو اڀياس ڪيو ويو آهي ڪلينڪل استعمال لاءِ.تازو، IFNα جي ٻين ذيلي قسمن تي تحقيق تي خاص ڌيان ڏنو ويو آهي.هڪ تازي مطالعي مان ظاهر ڪيو ويو آهي ته IFNα14 HBV2 ۽ HIV-13,4 جي نقل کي محدود ڪرڻ ۾ سڀ کان وڌيڪ مؤثر isoforms مان هڪ آهي Canonical IFNα2 ذيلي قسم جي مقابلي ۾.
اهو قائم ڪيو ويو آهي ته چالو ٿيل قسم I انٽرفيرون ريڪارڊر ڪمپليڪس (IFNAR1 ۽ IFNAR2) جانس ڪنيزس TYK2 ۽ JAK15,6 جي وچ ۾ سگنل ٽرانزيڪشن ڪاسڪيڊ کي متحرڪ ڪن ٿا.اهي جانس ڪناسز فاسفوريليٽ سگنل ٽرانسڊيوسرز ۽ ٽرانسپشنل پروٽين ايڪٽيوٽرز (STAT1 ۽ STAT2) ٽائروسين جي باقيات تي SH2 ڊومين-ثالث هيٽروڊيمرائيزيشن 6 کي شروع ڪرڻ لاءِ.تنهن کان پوءِ، IRF9 STAT heterodimers کي پابند ڪري ٿو ته جيئن IFN-stimulated factor 3 جين (ISGF3) جو ٽرميرڪ ڪمپليڪس ٺاهي، جيڪو نيوڪليس ڏانهن منتقل ٿئي ٿو ۽ 2000 کان وڌيڪ انٽرفيرون-اسٽيموليڊ جينز (ISGs)5,87,6.
ISGs پيدائشي مدافعتي نظام جي پٺ جي هڏا ٺاهيندا آهن، خاص طور تي وائرل حملي جي جواب ۾.وائرل انفڪشن جي خلاف دفاع جي پهرين قطار جي طور تي، سيلز تيزيء سان سيلولر پروٽين جي وسيع رابطي کي ترتيب ڏئي ٿو، حياتياتي سرگرمين جي وسيع رينج سان.انهن پروٽينن ۾ شامل آهن نمونن جي سڃاڻپ ريڪٽرز، سگنلنگ ماليڪيولز، ٽرانسڪرپشن فيڪٽرز، ۽ پروٽينس سان سڌو اينٽي وائرل افعال، انهي سان گڏ مدافعتي ردعمل جا منفي ريگيوليٽر9.ISG سرگرمي تي تمام گهڻي معلومات اوور ايڪسپريشن اسڪرينز 10,11 يا جين سائليننگ ٽيڪنڪ (siRNA, RNAi ۽ CRISPR) 12,13 استعمال ڪندي فنڪشنل اسڪرين مان ايندي آهي جنهن ۾ انفرادي ISGs جو اظهار ڪيو ويندو آهي يا روڪيو ويندو آهي ۽ انهن جي سرگرمي کي مختلف وائرسن تي آزمايو ويندو آهي.جيتوڻيڪ انهن مطالعي کي انفرادي ISGs جي اينٽي وائرل ملڪيت جو اندازو لڳايو آهي، هر ISG جي بنيادي ماليڪيول ميڪانيزم گهڻو ڪري اڻڄاتل رهي ٿو.اهو عام طور تي قبول ڪيو ويو آهي ته ڪيتريون ئي پروٽين مڪمل سرگرمي کي يقيني بڻائڻ لاء هڪ يا وڌيڪ cytokines سان لهه وچڙ ۾ آهن، تنهن ڪري يا ته ISGs سڌو رابطو ڪن ٿا يا انهن جي وچ ۾ سيلولر پروٽين جي وچ ۾ آهي.مثال طور، هڪ تازو فوٽوڪراس لنڪ ٿيل پروٽومڪس مطالعو ATPase VCP/p97 کي هڪ اهم IFITM3 رابطي واري پارٽنر جي طور تي سڃاڻي ٿو، جنهن جي پابندي وائرل ذرات 14 سان IFITM3 جي ليسوسومل ترتيب، ٽرن اوور، ۽ cotransport ۾ خرابين جي ڪري ٿي.Immunoprecipitation استعمال ڪندي، اسان سڃاڻپ ڪئي VAPA، هڪ ويسڪل سان لاڳاپيل پروٽين، هڪ رابطي پارٽنر جي طور تي IFITM1/2/3 سان جيڪو وچولي ڪري ٿو ڪوليسٽرول-ثالث وائرل پختگي، ۽ اها تصديق ڪئي وئي هڪ ٻئي مطالعي ذريعي هڪ خمير ٻه-هائبرڊ سسٽم استعمال ڪندي.سائنسي مدد 15 , 16 .
هڪ بنيادي حياتياتي عمل انفڪشن جي دٻائڻ ۾ شامل آهي ۽ خطرناڪ تبديلي آهي اينٽيجن پريزنٽيشن، جيڪا ميجر هسٽوڪمپيٽيبلٽي ڪمپليڪس (MHC) ماليڪيولز جي وچ ۾ آهي.پيپٽائيڊس (8-12 امينو اسيد ڊگھا) ڪليو ٿيل، وقت کان اڳ ختم ٿيل يا غلط فولڊ ٿيل پروٽين مان MHC-I heterodimer (MHC-I ڳري ۽ هلڪي زنجيرن تي مشتمل آهن، جن کي β-2-microglobulin؛ β2M) 17,18 سڏيو ويندو آهي.نتيجي ۾ مستحڪم MHC-I ٽرمرز سيل جي مٿاڇري تي منتقل ڪيا ويندا آهن، جتي اهي CD8+ T سيلز (سيٽوٽوڪسڪ ٽي سيلز) 17 تائين انٽرا سيلولر پيپٽائيڊس پيش ڪندا آهن.ٽي سيلز انهن پيٿوجنز ۽ سيلز کي سڃاڻن ٿا ۽ تباهه ڪن ٿا جيڪي ٽيومر-مخصوص اينٽيجن کڻندا آهن.نتيجي طور، pathogens ۽ tumor cell اڪثر ڪري antigen پيش ڪرڻ جي عمل کي دٻائي مدافعتي نگراني کان بچڻ لاء.ان کان علاوه، MHC-I 40-90٪ انساني ٽومر ۾ گهٽجي ويو آهي ۽ اڪثر ڪري هڪ غريب prognosis19 سان لاڳاپيل آهي.
جين جيڪي پيٿوجنز کي جواب ڏيڻ ۾ ملوث آهن انهن کي لازمي طور تي آرام جي حالت ۽ فعال ٽرانسپشن جي حالت جي وچ ۾ تبديل ڪرڻ گهرجي.تنهن ڪري، ڪيترن ئي سيلولر پروٽينن کي مختصر عرصي دوران اعلي IFN مطالبن جي جواب ۾ شامل ٿيڻ جو فرض ڪيو ويو آهي، بشمول پروموٽر ڪرومٽين 20,21 جي ريموڊلنگ ۽ ترميم.اڪثر اڀياس IFN جي موجودگي ۾ انفرادي ISG پروٽين جي ڀائيوارن جي سڃاڻپ تي ڌيان ڏنو آهي.ماڊل سيل سسٽم ۾ ڪيترائي پروٽوڪمڪ ۽ ٽرانسڪيڪل اڀياس سيلولر نظارن تي IFN جي اثر کي واضح ڪيو آهي.بهرحال، انٽرفيرون پاران متحرڪ متحرڪ جي وڌندڙ سمجھڻ جي باوجود، اسان اڃا تائين ISGs جي شموليت بابت ٿورو ڄاڻون ٿا.جڏهن انٽرفيرون سگنلنگ جي پيچيدگي ۽ وقت تي منحصر متحرڪ تي غور ڪيو وڃي، ٻه سوال پيدا ٿين ٿا: (i) ڇا اهو ممڪن آهي ته تيز سگنلنگ ۾ شامل ملٽي پروٽينن ڪمپليڪس کي مستحڪم ۽ ڇڪڻ، ۽ (ii) ڇا انهن ڳالهين کي 3D اسپيس ۾ نقشي ڪري سگهجي ٿو؟
انهن مسئلن کي حل ڪرڻ لاء، اسان IFNα-حوصلہ افزائي پروٽين جي رابطي واري نيٽ ورڪ ۽ ان جي متحرڪات جو مطالعو ڪرڻ لاء ڪاميٽي اسپيڪٽروميٽري (CLMS) سان گڏ ڊسڪنيمائيڊ سبرٽ-ثالث ڪيميائي ڪراس-لنڪنگ (DSS) کي لاڳو ڪيو.ڊي ايس ايس وييو ۾ پروٽين ۽ / يا پروٽينن جي ڪمپليڪس جي قربت واري رهائش جي وچ ۾ ڪوولنٽ بانڊ شامل ڪري ٿو.بعد ۾ MS تجزيا ظاهر ڪن ٿا مخصوص ڪراس لنڪنگ سائيٽون جيڪي علائقن جي مقامي قربت کي ظاهر ڪن ٿيون هڪ خاص پروٽين جي اندر، جنهن کي اندروني رابطا سڏيو ويندو آهي، يا پروٽين ڪمپليڪس ۾ سبونٽس، جنهن کي باهمي تعلق سڏيو ويندو آهي.هن طريقي کي استعمال ڪندي، اسان ڪيترن ئي ناول پروٽين-پروٽين ڪمپليڪس جي نشاندهي ڪئي آهي ۽ انهي سان گڏ interferon-induced multiprotein interaction نيٽ ورڪ.انهن نون ڳالهين جي هڪ ذيلي سيٽ کي وڌيڪ جانچڻ سان، اسان اهو ظاهر ڪريون ٿا ته H2BFS (H2B هسٽون-قسم FS؛ ان کان پوءِ H2B طور حوالو ڏنو ويو آهي) ۽ MDN1 HLA-A لاءِ پابند ڀائيوار طور ڪم ڪن ٿا.
فلو-1 سيلز esophageal adenocarcinoma جي ويٽرو ماڊلز ۾ سڀ کان وڌيڪ سڃاتل آھن جيئن اھي esophageal tumors 22,23 جي اهم خصوصيتن جي نقل ڪن ٿا.جڏهن ته، سڀئي ٽاميون مدافعتي نه آهن، ۽ اهو طئي ڪرڻ لاء ته ڇا فلو-1 سيلز انٽرفيرون علاج جو جواب ڏين ٿا، اسان 72 ڪلاڪن تائين Flo-1 سيلز کي 10 ng/ml IFNα سان علاج ڪيو.فلو-1 سيلز pSTAT1 ۽ IRF1 جي شروعاتي شموليت ڏيکاريا، علاج کان 2 ڪلاڪ شروع ٿيڻ ۽ 72 ڪلاڪن تائين جاري رھيا، IRF1 جي اسٽيشنري سطحن ۾ وقت تي منحصر گھٽتائي سان (شڪل 1A).ISGs (MX1، IFITM1، OAS1 / 2، ۽ ISG15) 6 ڪلاڪن کان پوء مضبوط طور تي حوصلا افزائي ڪئي وئي، IFNα (شڪل 1A) کي کلاسک وچ ۽ دير واري مرحلي جي جوابن کي نقل ڪندي.گڏو گڏ، اهي ڊيٽا پيش ڪن ٿا ته هي سيلولر ماڊل استعمال ڪري سگهجي ٿو interferon جوابن جو مطالعو ڪرڻ لاء.
IFNα علاج کان پوءِ فلو-1 سيلز ۾ مختلف پروٽين جي اظهار جا جواب.(الف) فلو-1 سيلز ۾ پروٽين جو اظهار 10 ng/ml IFNα سان علاج ڪيو ويو 2، 6، 24، 48 ۽ 72 ڪلاڪن لاءِ اشارو ڪيل ISG اينٽي باڊيز استعمال ڪندي امونبلوٽ ذريعي تجزيو ڪيو ويو.(B) Coomassie نيري داغ SDS-PAGE جيل پوري سيل مان نڪتل ڊي ايس ايس سان ڪراس لنڪ ڪرڻ کان پوءِ ظاهر ڪيل وقتن ۽ ڪنسنٽريشن لاءِ.(سي) نمائندي اميونوبلوٽ جي جانچ ڪئي وئي p53 (DO-1) اينٽي باڊي سان ساڳي نموني مان پروٽين جي ڪراس لنڪنگ جي درجي جو جائزو وٺڻ لاءِ.
سيٽو پروٽين جي وچ ۾ رابطي واري منظر کي پڪڙڻ لاء، اسان ڊي ايس ايس استعمال ڪيو، هڪ وڏي پيماني تي استعمال ٿيل ڪراس لنڪنگ ايجنٽ ان جي اعلي جھلي پارمميبلٽي ۽ نسبتا مختصر رد عمل جي وقت جي ڪري.مختصر رد عمل جو وقت ڪراس لنڪ ٿيل پروٽين جي وڏي مجموعن جي ٺهڻ کي روڪڻ ۾ مدد ڪري ٿو، ان ڪري ڪراس لنڪر جي استحڪام کي برقرار رکڻ.بهتر ڊي ايس ايس ڪنسنٽريشن جو تعين ڪرڻ ۽ اوور ڪراس لنڪنگ کان بچڻ لاءِ، اسان پهريون ڀيرو سيلز کي 5، 2.5، ۽ 1 ايم ايم ڊي ايس ايس تائين 5، 10، 5 ۽ 30 منٽن لاءِ بي نقاب ڪيو، ۽ Coomassie-stained SDS-PAGE پاران lysates جو تجزيو ڪيو. (ڊيٽا نه ڏيکاريل آهي).Cell lysates تمام گھٽ ڪنسنٽريشن تي ۽ تمام گھٽ وقت واري نقطي تي تمام گھڻو ڳنڍيل نظر اچن ٿا.تنهن ڪري، ڊي ايس ايس کي 1، 0.5، ۽ 0.1 ايم ايم تي 5 منٽن تي ٽائيٽ ڪيو ويو (شڪل 1B).5 منٽ لاءِ 0.5 ايم ايم ڊي ايس ايس سان بهترين ڪراس لنڪنگ ڏٺو ويو، ۽ اهي حالتون IFNα سان علاج ڪيل سيلز لاءِ چونڊيا ويا.ان کان علاوه، شڪل 1C ڏيکاري ٿو هڪ مغربي بلٽ استعمال ڪندي p53 (DO-1) اينٽي باڊي جو اندازو لڳائڻ لاءِ پروٽين ڪراس لنڪنگ جي درجي جو جائزو وٺڻ لاءِ.
ڪراس لنڪر شامل ڪرڻ کان اڳ 24 ڪلاڪن لاءِ Flo-1 سيلز 10 ng/ml IFNα سان علاج ڪيا ويا.ڪراس-منسلڪ سيلز بعد ۾ ٻه-قدم پروٽوليسس ذريعي ليس ڪيا ويا ۽ پروٽين کي FASP (Fig. 2) 24,25 ذريعي پروسيس ڪيو ويو.ڪراس-منسلڪ ٽرپٽيڪ پيپٽائڊس ماس اسپيڪٽروميٽري پاران تجزيو ڪيو ويو (تصوير 2).MS / MS اسپيڪٽرا وري پروٽين جي ترتيب سان ملائي رهيا آهن ۽ MaxQuant26,27 سان گڏ ڪيا ويا آهن.سم-ايڪس ايل پروگرام استعمال ڪندي حاصل ڪيل اسپيڪٽرا مان ڪراس-منسلڪ پيپٽائڊس جي سڃاڻپ ڪئي وئي، ۽ انفرادي مرکبات xQuest28 ۽ SIM-XL29 اوپن سورس ڪمپيوٽنگ سافٽ ويئر پائپ لائنز استعمال ڪندي هڪ پيچيده نيٽ ورڪ ۾ گڏ ڪيا ويا (تصوير 2).SIM-XL پروٽين-پروٽين جي رابطي، اندروني زنجيرن ۽ انفرادي زنجيرن کي سادي يا پيچيده پروٽين جي ميلاپ ۾ سڃاڻي ٿو ۽ پروٽين جي جوڙجڪ ۾ رابطي کي ڏسڻ لاء اسڪرپٽ مهيا ڪري ٿو.ان کان علاوه، اهو MS/MS29 اسپيڪٽرم معيار جي مطابق هڪ ID سکور جي طور تي هر ڪراس ريفرنس جي درجه بندي ڪري ٿو.ڪيترائي انتهائي قابل اعتماد پروٽين-پروٽين جي وچ ۾ رابطي ۽ ڪمپليڪس جي نشاندهي ڪئي وئي آهي، ۽ رابطي جي هڪ نئين سيٽ کي وڌيڪ تحقيق ڪئي وئي آهي co-immunoprecipitation ۽ ڪمپليڪس جي تبديلين جي استعمال سان ماليڪيولر ڊائنامڪس (MD) ماڊلنگ (Fig. 2) 30, 31.
CLMS طريقي جو اسڪيمي جائزو.Flo-1 سيلز کي 10 ng/ml IFNα سان 24 ڪلاڪن تائين علاج ڪيو ويو، بعد ۾ ڊي ايس ايس استعمال ڪندي سيٽو پروٽين ڪراس-لنڪنگ ۾ سيل ليسس ۽ ٽرپسنائيزيشن جي پٺيان.ڪراس سان ڳنڍيل نمونن جو تجزيو ڪيو ويو Orbitrap mass spectrometer استعمال ڪندي ۽ LC-MS/MS دوران پيپٽائڊ اڳوڻن جي ٽڪراءَ لاءِ وڌيڪ نمونو.حاصل ڪيل اسپيڪٽرا مان ٻن ڳنڍيل پيپٽائڊس جي سڃاڻپ ڪئي وئي اسپيڪٽرم ريڪگنيشن مشين آف دي ڪراس لنڪڊ پيپٽائڊس (SIM-XL) پروگرام جي استعمال سان، ۽ سڀني مرڪب کي ڪمپيوٽيشنل پائپ لائنز استعمال ڪندي هڪ پيچيده نيٽ ورڪ ۾ شامل ڪيو ويو.غلط مثبت شرح (FDR) سکور جي بنياد تي گھٽ اعتماد واري ڳالھ ٻولھ کي فلٽر ڪريو.ڪيترن ئي نئين اعلي مخلص پروٽين-پروٽين جي رابطي جي وڌيڪ تصديق ڪئي وئي co-immunoprecipitation استعمال ڪندي، ۽ ڪمپليڪس ۾ ٺهڪندڙ تبديلين کي ماليڪيولر ڊائنامڪس (MD) ماڊلنگ استعمال ڪندي جانچيو ويو.
مجموعي طور تي ~ 30,500 ۽ ~ 28,500 پيپٽائيڊس ڳوليا ويا MaxQuant استعمال ڪندي غير متحرڪ ۽ متحرڪ IFNα نموني ۾، ترتيب سان (ضمني جدول S1، تصوير 3A).ٻنهي صورتن ۾ پيپٽائڊ ڊگھائي ورڇ وڏي پيپٽائڊس جو وڌيڪ تناسب ڏيکاريو، جيڪو ڪراس سان ڳنڍيل پيپٽائڊس جي موجودگي کي ظاهر ڪري ٿو (Fig. 3B,C).ان کان سواء، وڏي پيپٽائڊس جو هڪ وڏو تناسب IFNα-علاج ٿيل نموني ۾ 40-55 جي حد ۾ موجود هئا (Fig. 3C).log2 جي شدت جي خلاف پروٽين جي نقشي سازي ڏيکاري ٿي ته کلاسي interferon-stimulated پروٽين تمام گهڻيون هيون، جن ۾ علاج نه ٿيل نمونن جي مقابلي ۾، جن ۾ MX1، IFIT1/3، OAS2/3، DDX58، ۽ HLA-F (Figure 3D).IFNα علاج جي جواب ۾ ٽن گنا کان وڌيڪ پروٽين جي طريقن جو تجزيو Reactome pathway ڊيٽابيس استعمال ڪندي ڏيکاريو ويو آهي ته MHC-I-ثالث اينٽيجن پيشڪش ۽ پروسيسنگ سڀ کان وڌيڪ غالب رستو هو (شڪل 3E).اڳين رپورٽن سان مطابقت، اينٽي وائرل جوابن جي وچ ۾ OAS ۽ ISG15 سان گڏوگڏ IFNα/β ۽ cytokine سگنلنگ چالو ٿيل رستن ۾ شامل هئا.ان کان سواء، lysine- ۽ سيرين-مخصوص پروٽين ڪراس لنڪس جي سڃاڻپ ڪئي وئي اصل ۾ حاصل ڪيل MS / MS اسپيڪٽرا مان SIM-XL استعمال ڪندي.هڪ تازي مطالعي جي رپورٽ ڪئي وئي 104 ISGs 20 وائرس 9 وائرس طبقن مان 5 سيل جي قسمن ۾ انفرادي ISG اوور ايڪسپريشن مطالعي جي ميٽا تجزيي ذريعي.بهرحال، وڏي ڊيٽا سيٽن جي اسڪريننگ جي حسابي حدن کي ختم ڪرڻ لاءِ، اسان هڪ ننڍي ڊيٽا سيٽ سان شروع ڪيو آهي ته جيئن IRDS جين جي فهرست جي وچ ۾ ممڪن رابطي کي ڳولڻ لاءِ Padaria et al.، جن مان اڪثر ISGs آهن.
IFNα (MaxQuant مان حاصل ڪيل ڊيٽا).(الف) وين ڊراگرام IFNα14 علاج ٿيل ۽ غير علاج ٿيل فلو-1 نموني ۾ سڃاڻپ عام ۽ خاص پيپٽائڊس جي تعداد جي نمائندگي ڪري ٿو.غير علاج ٿيل (B) ۽ IFNα علاج ٿيل (سي) ڪراس لنڪ ٿيل نموني جي پيپٽائڊ ڊگھائي ورڇ.(ڊي) گرمي جو نقشو log2 (LFQ شدت) جي نمائندگي ڪري ٿو اڻ علاج ٿيل ۽ IFNα14 جي وچ ۾ علاج ٿيل فلو-1 سيلز.کاٻي پينل IFNα جي موجودگي ۾ سڀ کان وڌيڪ فعال طور تي چالو ڪيل پروٽين کي ڏيکاري ٿو.(اي) هسٽوگرام IFNα علاج کان پوءِ 20 وڏين افزودگي جي رستن جي نمائندگي ڪري ٿو.Reactome pathway ڊيٽابيس تجزيي ڪئي وئي چار کان وڌيڪ تبديلين ۾ تبديل ٿيل IFNα-responsive پروٽين ۾.
Interferon-mediated ISG stimulation چڱي طرح دستاويز ٿيل آهي، پر ماليڪيولر سطح تي اهو خراب طور تي سمجھيو ويو آهي ته اهي پروٽين هڪ وسيع رينج ۾ حياتياتي افعال کي ڪيئن ختم ڪن ٿا.اسان تحقيق ڪئي پروٽين جي وچ ۾ رابطي جي اعلي سطحي اعتماد سان ڄاڻايل ISGs جي وچ ۾.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته اسان هڪ نيٽ ورڪ جي سڃاڻپ ڪئي جنهن ۾ MX1، USP18، ROBO1، OAS3، ۽ STAT1 پروٽين شامل آهن جيڪي IFNα علاج جي جواب ۾ هڪ وڏي پيچيده ٺاهيندا آهن (شڪل 4، ٽيبل S2) 32,33,34.سڀ کان وڌيڪ اھم، اھي ڳالھيون IFNα سان علاج ڪيل سڀني ٽرپليڪٽس ۾ مليا آھن ۽ غير علاج ٿيل نمونن ۾ نه مليا آھن، اھو مشورو ڏنو ويو آھي ته اھي خاص طور تي IFNα علاج جي جواب ۾ ٺاھيا ويا آھن.اهو معلوم ٿئي ٿو ته STAT1 ٽرانسپشن طور تي انهن ISGs جي اظهار کي منظم ڪري ٿو، پر پروٽين جي سطح تي ISGs سان ان جي رابطي جو اڀياس نه ڪيو ويو آهي.STAT1 جي ڪرسٽل ڍانچي ڏيکاري ٿي ته ان جو هيليڪل ڊومين (CCD) ڊي اين اي يا پروٽومر سان رابطي ۾ شامل نه آهي dimers35 جي ٺهڻ دوران.اهي α-helices هڪ هيليڪل هيلڪس ڍانچي ٺاهيندا آهن جيڪي هڪ بنيادي طور تي هائيڊروفيلڪ سطح واري ايراضي مهيا ڪن ٿيون جيڪي رابطي لاء 35.اسان جي CLMS ڊيٽا ۾، اسان ڏٺو آهي ته STAT1 سان تمام گهڻيون ڳالهيون SH2 ڊومين ۾ سي سي ڊي، لنڪر ڊومين، يا سي-ٽرمينل دم (باشون 700-708) (شڪل 4A) کان اڳ ۾ واقع ٿيون.هڪ پوئين اڀياس ٻڌايو ته USP18 STAT2 جي CCD ۽ DNA-binding ڊومين (DBD) سان جڙيل آهي ۽ قسم I interferon receptor IFNAR2 جي ذيلي يونٽ ۾ نوڪر ڪيو ويو آهي ته جيئن قسم I انٽرفيرون سگنلنگ 24 جي مداخلت کي روڪيو وڃي.اسان جي ڊيٽا پڻ ڏيکاري ٿي ته USP18 ڪيٽيليٽڪ ڊومين STAT1 DBD (Figure 4A,D) سان رابطو ڪري ٿو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته ٻئي STAT1 ۽ STAT2 شايد ڪردار ادا ڪن ٿيون USP18 کي IFNAR2 ڏانهن راغب ڪرڻ ۾.
پروٽين-پروٽين ISG نيٽ ورڪ جي سڃاڻپ ڪراس ڳنڍيل سيلز ۾ IFNα سان علاج ڪيو ويو.(الف) 2D رابطي وارو پلاٽ پروٽين-پروٽين جي وچ ۾ رابطي کي ڏيکاري ٿو (سم-ايڪس ايل پروگرام ۾ ٺاهيل)، لائين سان گڏ بين الاقوامي رابطي جي نمائندگي ڪن ٿا (ڪراس لنڪ ڪٽ آف سيٽ 3.5 تي).مختلف سڃاڻپ جا ڊومينز انهن جي رنگن سان نشان لڳل آهن32: MX1 ڊومين، Dynamin_N (73-249)، Dynamin_M (259-547)، ۽ GED (569-660).OAS3 ڊومينز: OAS1_C (160-344)، OAS1_C (559-745)، NTP_transf_2 (780-872)، ۽ OAS1_C (903-108).ڊومين ROBO1، Ig_3 (67-151)، I-set (170–258)، I-set (262–347)، Ig_3 (350–432)، Ig_3 (454–529)، fn3 (562–646)، fn3 (678-758) ۽ fn3 (777-864).STAT1 فيلڊز: STAT_int (2-120)، STAT_alpha (143-309)، STAT_bind (321-458)، SH2 (573-657)، ۽ STAT1_TAZ2bind (715-739).(ب) ڪراس-منسلڪ پروٽينس (MX1، UBP18، OAS3، ROBO1، ۽ STAT1) جو سرڪيولر ناظر، ترتيب سان نيري ۽ ڳاڙهي ۾ ليبل ٿيل رابطي ۽ رابطي سان.ڪراس لنڪ جي حد مقرر ڪئي وئي 3.5 تي.ڊٽ پلاٽ ظاهر ڪن ٿا STAT1 رابطي واري سائيٽن سان MX1 (C)، USP18 (D)، ROBO1 (E)، ۽ OAS3 (F)، انهي سان گڏ K يا S رابطي واري سائيٽن سان ٻن پيپٽائڊس جي وچ ۾.شڪل ۾، ڪراس لنڪ سکور جي حد مقرر ڪئي وئي آهي 3.0.(G) STAT1 ۽ OAS3 DI ڊومينز جي وچ ۾ مختلف رابطي واري سائيٽون PyMol (PyMOL ماليڪيولر گرافڪس سسٽم، ورزن 2.0 Schrödinger, LLC.) ۾ انهن جي پروٽين جي جوڙجڪ تي سپرمپوز ٿيل آهن.STAT1 (pdb id: 1bf533) ۽ OAS3 (pdb id: 4s3n34).) پروگرام.
انسانن ۾ USP18 جا ٻه isoforms بيان ڪيا ويا آهن، هڪ مڪمل ڊگھي پروٽين جيڪا خاص طور تي نيوڪليس ۾ واقع آهي، ۽ هڪ isoform بغير ڪنهن N-ٽرمينل ڊومين جي، USP18-sf، جيڪا هڪجهڙائي سان ورهايل آهي cytoplasm ۽ nucleus 36 ۾.ان کان علاوه، N-terminus جي اڳڪٿي ڪئي وئي هئي غير منظم ٿيڻ ۽ isopeptidase سرگرمي يا ISG1537 پابند جي ضرورت ناهي.اسان جي مطالعي ۾ سڃاتل گھڻا لاڳاپا پروٽين جي اين-ٽرمينس تي واقع هئا، اهو مشورو ڏئي ٿو ته انهن ڳالهين ۾ شامل آهي مڪمل ڊگھائي USP18 (Figure 4A,D) ۽ اهڙيء طرح ممڪن آهي ته نيوڪيوس ۾.ان کان علاوه، اسان جي ڊيٽا پڻ ظاهر ڪري ٿي ته N-terminus پروٽين کان پروٽين جي رابطي لاء خاص آهي.IFNAR2 بائنڊنگ سائيٽ باقي 312-368 جي وچ ۾ واقع آهي، ۽ خاص طور تي، پيچيده ۾ ڪو به پروٽين هن علائقي سان جڙيل ناهي (تصوير 4A) 37,38.اهي ڊيٽا گڏ ڪيا ويا آهن ظاهر ڪن ٿا ته IFNAR2 پابند ڊومين خاص طور تي ريڪٽر پروٽين پاران استعمال ڪيو ويندو آهي.ان کان علاوه، صرف OAS3 ۽ ROBO1 مليا ويا ڊومينز سان لاڳاپيل N-terminus ۽ IFNAR2 بائنڊنگ سائيٽ (شڪل 4A).
ROBO1 جو تعلق immunoglobulin (Ig) سپر فيملي جي transmembrane signaling molecules سان آهي ۽ اهو پنج Ig ڊومينز ۽ ٽي fibronectin (Fn) ڊومينز تي مشتمل آهي ٻاهرين علائقي ۾.اهي خارجي خاني وارا ڊومينز هڪ جھلي جي ويجهڙائي واري علائقي ۽ هڪ واحد ٽرانسميمبرن هيلڪس 39 جي پٺيان هوندا آهن. هڪ غير تعمير ٿيل اندروني علائقي سي-ٽرمينس تي واقع آهي ۽ محفوظ ڪيل تسلسل نقشن تي مشتمل آهي جيڪو وچولي اثر ڪندڙ پروٽين جي پابند آهي39.امينو اسيد ~ 1100 کان 1600 تائين پکڙيل علائقو گهڻو ڪري بيڪار آهي.اسان ڏٺو ته MX1 ROBO1 سان Ig، Fn، ۽ intracellular ڊومينز ذريعي رابطو ڪري ٿو، جڏهن ته STAT1 سان سڀ کان وڌيڪ تعامل ان جي CCD، لنڪر ڊومين، ۽ ROBO1 جي C-ٽرمينس (Fig. 4A,E) جي وچ ۾ ٿين ٿا.ٻئي طرف، DI، DIII، ۽ OAS3 لنڪر علائقن سان رابطي کي سڄي ROBO1 پروٽين (Fig. 4A) ۾ ورهايو ويو.
oligoadenylate synthase (OAS) پروٽين فيملي intracellular double-stranded RNA (dsRNA) کي قبول ڪري ٿو ۽ پابند ڪري ٿو، ٺھيل تبديلين مان گذري ٿو، ۽ 2′,5′-linked oligoadenylates (2-5 As) 40 .اهو معلوم ٿيو ته ٽن OASs مان، OAS3 dsRNA لاءِ سڀ کان وڌيڪ لاڳاپو ڏيکاري ٿو ۽ گهٽ ۾ گهٽ 2-5 As جي مقدار کي گڏ ڪري ٿو، جيڪو RNase L کي چالو ڪري سگهي ٿو ۽ ان سان وائرل نقل 41 کي محدود ڪري ٿو.OAS خاندان پوليميرس بيٽا (pol-β) جھڙوڪ نيوڪليوٽائڊ ٽرانسفيس ڊومينز تي مشتمل آھي.پوئين تحقيق ڏيکاريو ويو آهي ته C-ٽرمينل ڊومين (DIII) جي ڪيٽيليٽڪ سرگرمي dsRNA-بائنڊنگ ڊومين (DI) تي منحصر آهي، جيڪو OAS342 جي چالو ڪرڻ لاء گهربل آهي.اسان ڏٺو ته OAS3 جي DI ۽ DII ڊومينز CCD ۽ SH2 ۽ STAT1 TAD (شڪل 4A، F) جي وچ ۾ ننڍڙي جنڪشن واري علائقي سان رابطو ڪن ٿا.پروٽين جي جوڙجڪ تي مختلف ڪراس لنڪنگ سائيٽن کي اوورلي ڪرڻ β-sheet ۽ DBD STAT1 لوپ جي وچ ۾ رابطي کي ظاهر ڪيو ۽ OAS3 (Fig. 4G) جي DI ڊومين ۾ 60-75 جي باقيات مان ٺهيل هڪ کليل کيسي يا گفا.ڪمپليڪس ۾ پروٽينن جي واقفيت پڻ اشارو ڪيو ته OAS3 سان ڪنهن به رابطي جي مداخلت ان جي ڊي ڊومين جي ڊي اين اي-بائنڊنگ قابليت سان مداخلت نه ڪئي (Fig. S1A).ان کان علاوه، GTPase MX1 جو N-ٽرمينل ڊومين OAS3 (Fig. 4A) جي DI ۽ DIII ڊومينز سان وسيع طور تي رابطو ڪري ٿو.اسان سڀني ٽن IFNα-علاج ٿيل ورجائن ۾ OAS1 ۽ MX1 جي وچ ۾ رابطي جو پڻ مشاهدو ڪيو، جتي هڪ واحد OAS1 ڊومين (پڻ اتساهه طور تي فعال) سڀني ٽن MX1 ڊومينز سان رابطو ڪيو (شڪل S2A، B).
MX پروٽين هڪ وڏي خاندان جو حصو آهن ڊائنين جهڙوڪ GTPases جنهن ۾ هڪ N-ٽرمينل GTPase ڊومين شامل آهي جيڪو GTP کي پابند ۽ هائيڊولائيز ڪري ٿو، هڪ وچولي ڊومين جيڪو پاڻ کي اسيمبليءَ ۾ ثالث ڪري ٿو، ۽ هڪ C-ٽرمينل ليوسائن زپ جيڪو ڪم ڪري ٿو GTPase (LZ) ).ڊومين اثر ڪندڙ ڊومين 25,43.MX1 وائرل جين 43 جي ٽرانسڪرپشن کي بلاڪ ڪرڻ لاءِ وائرل پوليمرسس جي ذيلي يونٽن سان جڙيل آهي.هڪ اڳوڻي رپورٽ ٿيل خمير ٻه-هائبرڊ اسڪرين ڏيکاري ٿي ته PIAS1 سان لاڳاپيل MX1 STAT1-ثالث ٿيل جين چالو ڪرڻ کي روڪي ٿو ڊي اين اي-بائنڊنگ سرگرمي کي بلاڪ ڪندي ۽ ان ۾ SUMO E344,45 ligase سرگرمي پڻ آهي.هتي، اسان اهو ظاهر ڪريون ٿا ته MX1 STAT1 (Figure 4C،D) سان جڙيل آهي، جڏهن ته اهو رابطو ڪيئن اثر انداز ٿئي ٿو STAT1-ثالث جين چالو ٿيڻ جي جواب ۾ IFNα وڌيڪ مطالعي جي ضرورت آهي.ان کان علاوه، اسان اهو پڻ مليو آهي ته MX1 IFIT3 ۽ DDX60 سان گڏ سڀني ٽن IFNα-علاج ٿيل ورجائي (Fig. S2C) ۾.
DDX60 هڪ IFN-Induced cytoplasmic helicase آهي جيڪو اڳ ۾ ٻڌايو ويو آهي ته RIG-I-آزاديءَ ۾ وائرل RNA46 جي تباهي ۾ ڪردار ادا ڪن.اهو RIG-I سان رابطو ڪري ٿو ۽ ان جي سگنلنگ کي ligand-مخصوص انداز ۾ چالو ڪري ٿو 46. DDX60 هڪ DEXD/H-Box هيليڪيس ڊومين ۽ هڪ C-ٽرمينل هيليڪس ڊومين تي مشتمل آهي جيڪو وائرل RNA ۽ DNA47 کي پابند ڪري ٿو.MX1 ۽ IFIT3 سان ان جا گهڻا لاڳاپا ڊگھا N- ۽ C-ٽرمينل علائقن ۾ ڪننيڪل ڊومينز يا نقشن کان سواءِ ٿين ٿا (Fig. S2E,F).بهرحال، MX1 پڻ DEXD/H-Box هيليڪس ڊومين سان لاڳاپيل آهي (Fig. S2E).IFIT خاندان جي پروٽينن وٽ هڪ مخصوص هيلڪس-ٽرن-هيلڪس موٽف جي ٽينڊم ڪاپيون آهن جن کي ٽيٽراپيپٽائيڊ ريپيٽ (TPR) سڏيو ويندو آهي.IFIT3 ملي ويو RIG-I سگنلنگ جو هڪ مثبت ماڊلٽر ۽ ان ڪري MAVS ڪمپليڪس جو هڪ حصو.گڏ ڪيل، اسان جي ڊيٽا جو مشورو ڏنو ويو آهي ته IFIT3 ۽ DDX60 بنيادي طور تي IFIT3 جي TPR 3-6 جي وچ واري علائقي ۾ مداخلت ڪن ٿا ۽ RIG-I/MAVS سگنلنگ (Fig. S2F) ۾ ڪردار ادا ڪري سگھن ٿا.
ڏنو ويو آهي ته اسڪريننگ پوري پروٽوم کي ڪمپيوٽري طور تي سخت آهي، اسان وري مڪمل انساني يوني پروٽ ڊيٽابيس جي اسڪريننگ ڪئي IFNα-علاج ٿيل ريٽرن مان هڪ جي موجودگي لاء.هن نقل ۾، اسان HLA-A لاءِ ڪيترائي انتهائي قابل اعتماد رابطي جا نيٽ ورڪ ڏٺا.MS/MS اسپيڪٽرا پاران سڃاڻپ ڪيل پروٽين جي رستن جو تجزيو ڏيکاريو ويو آهي ته MHC-I-based antigen پروسيسنگ ۽ پريزنٽيشن بنيادي رستو آهي جيڪو انٽرفيرون (Fig. 3D) ذريعي ٺاهيل آهي.تنهن ڪري، اسان MHC-I ماليڪيولز جي پروٽين جي رابطي جي مطالعي تي ڌيان ڏنو، سڀني پار-منسلڪ نموني ۾ اعلي سطحي اعتماد سان.HLA α1، α2 ۽ α3 ڊومينز ۽ هلڪو زنجير تي مشتمل آهي، ۽ مائڪروگلوبولين β2 (β2m) هڪ مستقل چپرون پروٽين 49 آهي.هڪ دفعو انڊوپلاسمڪ ريٽيڪولم ۾ گڏ ٿيڻ بعد، ايڇ ايل اي پيپٽائڊ ligands50 جي غير موجودگي ۾ غير مستحڪم آهي.پيپٽائڊ بائنڊنگ گروو انتهائي پوليمورفڪ ۽ غير ترتيب ڏنل α1 ۽ α2 ڊومينز جي نان پيپٽائڊ فارم ۾ ۽ نسبتاً گهٽ پوليمورفڪ α351 ڊومينز مان ٺهيل آهي.IFNα جي موجودگي ۾، اسان ٻه HLA-A ڪمپليڪس ڳوليا: ھڪڙو HMGA1 ۽ H2B سان رابطو ڪري ٿو (شڪل 5، جدول S3) ۽ ٻيو MDN1، LRCH4 ۽ H2B سان رابطو ڪري ٿو (شڪل 6).
IFNα H2B (H2BFS) ۽ HMGA1 سان HLA-A رابطي واري نيٽ ورڪ کي متحرڪ ڪري ٿو.(الف) 2D پلاٽ (سم-ايڪس ايل سافٽ ويئر ۾ ٺاهيل) H2B-HLA-A-HMGA1 ڪمپليڪس ۾ مختلف قسمن جي رابطي کي ظاهر ڪري ٿو: انٽ لنڪ (نيرو)، انٽ لنڪ (ڳاڙهو) ۽ سنگل لنڪ (ڪارو)..مختلف سڃاڻپ جا ڊومينز رنگ ڪوڊ ٿيل آهن 32: H2B (هسٽون؛ 2-102) ۽ MHC-I (MHC_1؛ 25-203، گروپ C1؛ 210-290 ۽ MHC_I_C؛ 337-364).ڪراس لنڪ جي حد مقرر ڪئي وئي 3.5 تي.ڊٽ پلاٽ H2B (B) ۽ HMGA1 (C) سان گڏ HLA-A رابطي واري سائيٽن کي ظاهر ڪن ٿا، انهي سان گڏ K يا S ٻن پيپٽائڊس جي وچ ۾ رابطي واري سائيٽون.شڪل ۾، ڪراس لنڪ سکور جي حد مقرر ڪئي وئي آهي 3.0.(D) PyMOL پروگرام ۾ H2B، HLA-A، ۽ HMGA1 پروٽين جي جوڙجڪ ۾ ڏيکاريل پروٽين جي وچ ۾ لاڳاپا.اهي اڏاوتون Phyre2 سرور (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) استعمال ڪندي ماڊل ڪيون ويون ۽ H2B، HLA-A ۽ HMGA1 پروٽينس لاءِ ٽيمپليٽ ڍانچو ترتيبوار 1kx552، 1kj349 ۽ 2eze55 هئا.
IFNα H2B (H2BFS)، MDN1 ۽ LRCH4 سان HLA-A رابطي واري نيٽ ورڪ کي متحرڪ ڪري ٿو.(الف) Intramolecular (ڳاڙهو) ۽ intermolecular (نيري) ڪراس لنڪس هڪ 2D انٽرايڪٽو نقشي تي پيش ڪيا ويا (سم-XL سافٽ ويئر ۾ ٺاهيل) MDN1 سان گڏ هڪ دائري جي نمائندگي ڪئي وئي.ڪراس لنڪ جي حد مقرر ڪئي وئي 3.5 تي.مختلف شناختن جا ڊومينز رنگ ڪوڊ ٿيل آهن 32: H2B (هسٽون؛ 2-102)، MHC-I (MHC_1؛ 25-203، گروپ C1؛ 210-290 ۽ MHC_I_C؛ 337-364) ۽ LRCH4 (LRR_8 (68-126)، LRR_8 (137-194) ۽ CH (535-641)).(B) PyMOL پروگرام ۾ H2B، HLA-A، LRCH4، ۽ MDN1 پروٽين جي جوڙجڪ ۾ ڏيکاريل پروٽين جي وچ ۾ لاڳاپا.اهي اڏاوتون Phyre2 سرور (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) استعمال ڪندي ماڊل ٺاهيا ويا 1kx552، 1kj349، 6hlu62 ۽ 6i2665 سان گڏ H2B، HLA-A، LRCH4 ۽ MDN1 پروٽين، ترتيب سان.ڊٽ پلاٽ ڏيکاريندڙ K يا S رابطي واري سائيٽن لاءِ HLA-A سان H2B (C)، LRCH4 (D)، ۽ MDN1 (E).پلاٽن لاءِ، ڪراس لنڪ اسڪور جي حد مقرر ڪئي وئي 3.0.
جينوم جي سالميت کي برقرار رکڻ کان علاوه، هسٽون H2B ٽرانسپشن جي ضابطي ۾ پڻ شامل آهي.H2B پروٽين هڪ مرڪزي هسٽون ڊومين (HFD) تي مشتمل آهي جيڪو ٽن α-helices پاران ٺهيل آهي لوپس ۽ هڪ C-ٽرمينل دم 41,52.H2B سان تمام گهڻو رابطو α1 هيلڪس ۾ ٿئي ٿو، جيڪو HFD heterodimer (Fig. 5A,B) سان ٽرميرائيزيشن مهيا ڪري ٿو.جيتوڻيڪ lysins DNA بائنڊنگ ۾ ملوث آهن، ڪجهه lysins متبادل acetylation يا methylation سائيٽون پڻ آهن.مثال طور، H2B کان K43، K46، ۽ K57 جي باقيات سڌي ڊي اين اي بائنڊنگ ۾ ملوث نه آهن، پر مختلف پوسٽ ٽرانسپشنل ترميمن جا مقصد آهن53.اهڙي طرح، H2B ۾ K44، K47، ۽ K57 جي باقيات IFNα جي موجودگي ۾ متبادل ڪردار ادا ڪري سگھن ٿيون، بشمول ٻين پروٽينن سان رابطي ۾ (تصوير 5A، B).ان کان علاوه، extrachromosomal histone H2B مختلف سيلن جي قسمن ۾ مدافعتي ردعمل کي چالو ڪري ٿو، هڪ cytosolic sensor طور ڪم ڪري ٿو ڊبل-stranded DNA (dsDNA) ٽڪڙن کي ڳولڻ لاءِ جيڪي متاثر ٿيندڙ ايجنٽن يا خراب ٿيل سيلز مان نڪتل آهن54.ڊي اين اي وائرس جي موجودگي ۾، H2B جي گهٽتائي IFN-β جي پيداوار ۽ STAT154 فاسفوريليشن کي روڪيو.H2B ٻين بنيادي هسٽونز جي ڀيٽ ۾ وڌيڪ تيزيءَ سان نيوڪلئس جي اندر ۽ ٻاهر وڃڻ لاءِ پڻ سڃاتو وڃي ٿو54.MDN1 ۽ LRCH4 سان H2B رابطي پڻ چونڊيل غير علاج ٿيل نمونن ۾ ڏٺو ويو.اسان ڏٺو ته HLA-A H2B سان سڀني ٽن IFNα-علاج ٿيل نمونن ۾ ۽ هڪ غير علاج ٿيل نموني نموني ۾.اهي ڊيٽا H2B جي ڪردار کي ظاهر ڪن ٿا متبادل جسماني فنڪشن ۾ ٽرانسپشنل ريگيوليشن کان آزاد.
HMGA1 (High mobility group AT-Hook 1)، ھڪڙو ننڍڙو نيوڪليوپروٽين آھي جيڪو بيماريءَ کي وڌائڻ واري امينو اسيد ۾ مالامال آھي، جنھن کي HLA-A سان واسطو رکي ٿو.ان ۾ هڪ تيزابي سي-ٽرمينل دم ۽ ٽي الڳ DBDs آهن جن کي AT hooks سڏيو ويندو آهي ڇاڪاڻ ته اهي dsDNA55,56 ۾ AT-rich علائقي جي ننڍڙي نالي سان جڙيل آهن.هي پابند ڊي اين اي کي موڙي يا سڌو ڪرڻ جو سبب بڻائيندو آهي، ان جي اتفاق جي ترتيب تائين رسائي جي ڪننيڪل ٽرانسپشن عوامل کي اجازت ڏئي ٿي.سي-ٽرمينل دم کي پروٽين-پروٽين جي وچ ۾ رابطي ۽ ٽرانسپشن فيڪٽرز جي ڀرتي ۾ ملوث سمجهيو ويندو آهي، ڇاڪاڻ ته سي-ٽرمينل کي ختم ڪرڻ واري ميوٽيٽ ٽرانسپشن کي شروع ڪرڻ کان قاصر آهن57.ان کان علاوه، هن ڊومين ۾ ڪيترن ئي محفوظ ڪيل فاسفوريليشن سائيٽن تي مشتمل آهي جيڪي ڪنيز 58 لاء ڄاڻايل ذيلي ذيلي ذيلي ذخيري آهن.اسان HLA-A ۽ H2B رابطي کي HMGA1 سان سي-ٽرمينل ڊومين کان ٻاهر ڏٺو، اهو مشورو ڏنو ويو آهي ته سي-ٽرمينل ڊومين بنيادي طور تي ٽرانسپشن فيڪٽر بائنڊنگ لاء استعمال ڪيو ويندو آهي (Fig. 5A, C).HMGA پروٽينس اڊاپٽر ڊي اين اي کي پابند ڪرڻ لاءِ هسٽون H1 سان مقابلو ڪن ٿا، ان ڪري پهچ ۾ واڌارو ٿئي ٿو57.اهڙي طرح، اهو لڳي ٿو ته HMGA هسٽون H2B سان ڳنڍيل ڊي اين اي سان گڏ هسٽون H1 سان مقابلي ۾.HMGB1 dendritic سيلز ۾ HLA-A، -B، ۽ -C جي اظهار کي متاثر ڪري ٿو، انهن جي چالو ٿيڻ جي ڪري 59، پر HMG ۽ HLA جي وچ ۾ رابطي جي اڳ ۾ رپورٽ نه ڪئي وئي آهي.اسان ڏٺو ته HMGA1 HLA-A جي α1 ۽ α3 ڊومينز سان رابطو ڪري ٿو، ان جي 3 DBD (Figure 5A,C) کان ٻاهر اڪثر ڳالهين سان.اسان جي ھٿن ۾، HLA-A کي نيوڪيئس (ڊيٽا نه ڏيکاريل آھي) ۾ مقامي طور تي مليل آھي، ۽ ڏنو ويو آھي ته H2B ۽ HMGA1 پڻ نيوڪلئس ۾ موجود آھن، ھي رابطي جو امڪان آھي نيوڪيئس ۾.H2B، HLA-A، ۽ HMGA1 جي وچ ۾ ماپيل مخصوص اضافو شڪل 5D ۾ ڏيکاريا ويا آھن.
HLA-A جي ٻين پروٽينن سان گهڻيون ڳالھيون ان جي α1 ۽ α2 ڊومينز ۽ خراب ٿيل سي-ٽرمينل ڊومين جي اندر ٿينديون آهن (تصوير 6).انهن مثالن مان هڪ ۾، اسان ڏٺو ته HLA-A LRCH4 (Figure 6A,D) جي بي ترتيب ٿيل N-ٽرمينل دم سان رابطو ڪري ٿو.LRCH4 TLR4 ايڪٽيويشن ۽ LPS سائٽوڪائن انڊڪشن کي منظم ڪري ٿو، ان ڪري فطري مدافعتي ردعمل 60,61 کي ماڊل ڪري ٿو.اهو هڪ جھلي پروٽين آهي جنهن ۾ نو ليوسين-رچ ريپيٽس (LRRs) ۽ هڪ ڪلمودولين (CH) هومولوجي موٽف ان جي ايڪٽوڊومين ۾ آهي، جنهن جي پٺيان هڪ ٽرانسميمبرن ڊومين (TMD) 60، 62 آهي.CH ڊومينز کي ٻڌايو ويو آهي ته وچولي پروٽين-پروٽين جي وچ ۾ رابطي 60.LRR ۽ CH ڊومينز جي وچ ۾ اٽڪل 300 امينو اسيد جو هڪ ڊگهو نسبتا رسائي لائق آهي پر بي ترتيب آهي.بي ترتيب علائقن جي ڪم جي بنياد تي پروٽين-پروٽين نيٽ ورڪ ۽ ويسڪولر ٽرانسپورٽ جي ثالث جي طور تي 63، اسان اهو معلوم ڪيو ته اڪثر پروٽين جي وچ ۾ تڪرار علائقن ۾ واقع ٿينديون آهن.MDN1 سان لاڳاپا پروٽين جي سڄي ڊيگهه ۾ ورهايو ويو، جنهن ۾ LRR1، LRR6، CH ڊومينز، ۽ بي ترتيب واري علائقي شامل آهن، جڏهن ته H2B بنيادي طور تي CH ڊومين (Fig. 6A، B) تي پابند آهي.خاص طور تي، ڪنهن به ڳالهه ٻولهه ۾ TMJ شامل نه آهي، CLMS طريقي جي خاصيت جو مشورو ڏئي ٿو (شڪل 6A، B).
MDN1 پڻ HLA-A پروٽين نيٽ ورڪ جي حصي طور سڃاتو ويو آهي (شڪل 6A).اهو پروٽين جي AAA خاندان سان تعلق رکي ٿو (اي ٽي پيز مختلف سرگرمين سان لاڳاپيل).اهو ساڳيو اين ٽرمينل AAA ڊومين آهي جيڪو هڪ هيڪسامرڪ انگوزي ۾ منظم ڪري ٿو ۽ 60S 64 ribosomal subunit مان اسيمبلي جي عنصر کي هٽائي ٿو.dynein64,65,66 سان ملندڙ جلندڙ نظر اچن ٿا.ان کان علاوه، اسپ/گلو امير علائقو MIDAS ڊومين (ميٽيل آئن تي منحصر سائيٽ) جي پٺيان آهي.MDN1 جي وڏي سائيز جي ڪري (تقريبن 5600 امينو اسيد) ۽ چڱيءَ طرح اڀياس ڪيل پروٽين سان گڏ ان جي محدود هومولوجي جي ڪري، انسانن ۾ ان جي ساخت ۽ ڪم جي باري ۾ ٿورڙي ڄاڻ آهي.اسان HLA-A، H2B، ۽ LRCH4 کي MDN1 بائنڊنگ پارٽنرز جي طور تي سڃاڻي ورتو ۽ پڌرو ڪيو انهن جي واقفيت کي پروٽين ڪمپليڪس جي طور تي PyMol (Fig. 6A,B).اهي ٽي پروٽينس AAA ڊومين سان تعلق رکن ٿا، ڊائنين وانگر لنڪر ڊومين، ۽ ممڪن طور تي MIDAS MDN1 ڊومين.هڪ پوئين رپورٽ ۾، بيت پروٽين جي لاڳاپي جي صفائي جي سڃاڻپ ڪئي وئي MDN1 هڪ پروٽين جي طور تي هسٽون H2B67 سان لاڳاپيل.ان کان علاوه، هڪ تازو مطالعو پڻ ٻڌايو ته MDN ۽ HLA-B جي وچ ۾ HCT116 سيلز ۾ لاڳاپا صاف ٿيل ماس اسپيڪٽروميٽري استعمال ڪندي، اسان جي نتيجن جي حمايت ڪندي68.IFNα-علاج ٿيل نمونن ۾ هن پيچيده جي سڃاڻپ انٽرفيرون سگنلنگ ۾ MDN1 لاءِ ڪردار پيش ڪري ٿي.
ڇاڪاڻ ته HLA جينز انتهائي پوليمورفڪ آهن، اسان Flo-1 سيلز جي RNA جي ترتيب واري ڊيٽا مان HLA-A، -B، ۽ -C جي ترتيب واري ريڊ ميپنگ کي ڪڍيو (ڊيٽا نه ڏيکاريل آهي).پيپٽائڊ جي ترتيبن جي ترتيب سان ترتيب ڏنل پڙھڻ سان معلوم ٿيو ته HLA-A، -B، ۽ -C جي وچ ۾ اھم فرق انھن علائقن ۾ جتي ڪراس سان ڳنڍيل پيپٽائڊس HLA-A ۾ واقع ھئا (شڪل S3).ان کان علاوه، اسان H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 پروٽين سان HLA-B/C ماليڪيولز جي پروٽين کان پروٽين جي ڪراس لنڪنگ جو مشاهدو نه ڪيو.هن مان معلوم ٿئي ٿو ته HLA-A، MDN1، LRCH1 ۽ HMGA1 جي وچ ۾ مليل پروٽين جي رابطي HLA-A مخصوص آهي.ان کان علاوه، غير ڪراس لنڪ ٿيل نمونن (ٽيبل S4) جي پروٽوميڪ تجزيي ڏيکاري ٿي ته HLA-A ۾ HLA-B يا HLA-C جي مقابلي ۾ وڌيڪ تسلسل ڪوريج آهي.HLA-A لاءِ سڃاڻپ ٿيل پيپٽائيڊس IFNα-علاج ٿيل ۽ غير علاج ٿيل نمونن ۾ شدت ۾ وڌيڪ هئا.
انهي ڳالهه کي يقيني بڻائڻ لاءِ ته هتي نشاندهي ڪيل ڳالهه ٻولهه ويجهي فضائي قربت ۾ ٻن پروٽينن جي غير مخصوص ڪراس ڳنڍڻ جي ڪري نه هئي، اسان وڌيڪ تصديق ڪئي ته ٻه نوان HLA-A تعامل ڪندڙ عنصر ڪو-امونوپريسيپٽيشن اسيسز کي انجام ڏيندي.HLA-A MDN1 ۽ H2B سان لاڳاپا ٻنهي IFNα-علاج ٿيل ۽ غير علاج ٿيل فلو-1 سيلز (شڪل 7، شڪل S4) ۾ ڳوليا ويا.اسان تصديق ڪئي ته HLA-A کي H2B پاران immunoprecipitates ۾ قبضو ڪيو ويو هو ۽ اهو انجمن IFNα علاج جي سبب هو ڇو ته HLA-A غير علاج ٿيل سيلز (Figure 7A) مان مدافعتي نموني ۾ غير حاضر هو.بهرحال، اسان جي ڊيٽا جو مشورو ڏنو ويو آهي ته IFNα مختلف طور تي HLA-A کي H2B ۽ MDN1 تي پابند ڪري ٿو.IFNα H2B ۽ HLA-A جي وچ ۾ تعلق پيدا ڪري ٿو، پر MDN1 سان ان جو تعلق گھٽائي ٿو.اسان اهو محسوس ڪيو ته MDN1 HLA-A سان لاڳاپيل هو ڪنٽرول ۾، ۽ IFNα جي اضافي کي IFNα (Figure 7B, C) پاران MDN1 انڊڪشن کان آزاد هن رابطي کي گھٽائي ڇڏيو.ان کان علاوه، HLA-A مدافعتي عمل H2B کي A549 سيلز (Fig. S4) ۾ قبضو ڪيو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته هي رابطي سيل جي قسم کان آزاد آهي.گڏجي گڏ ڪيو ويو، اهي نتيجا H2B ۽ MDN1 سان HLA-A جي مداخلت واري مداخلت جي حمايت ڪن ٿا.
HLA-A گڏيل طور تي H2B ۽ MDN1 کي صاف ڪري ٿو.نمائندي endogenous H2B (A) ۽ MDN1 (B) immunoblots IFNα-علاج ٿيل Flo-1 سيلز مان مدافعتي ٿي ويا ۽ ظاهر ڪيل اينٽي باڊيز جي جاچ ڪئي وئي.مائوس ۽ خرگوش IgG منفي ڪنٽرول طور استعمال ڪيا ويا.(سي) مختلف اينٽيجنز جا لاڳاپا مقدار (انپٽ) ڏيکاريل اينٽي باڊيز جي خلاف تحقيق ڪيل امونبلٽس پاران ظاهر ڪيا ويا آهن، β-actin استعمال ڪيو ويو لوڊنگ ڪنٽرول جي طور تي.
هڪ interferon-حوصلہ افزائي انتهائي قابل اعتماد ڪراس-منسلڪ نيٽ ورڪ، H2B-HLA-A-HMGA1 جي ساخت جي ملڪيت، تحقيق ڪئي وئي.اسان هن ڪمپليڪس ۾ شامل پروٽينن جي تخليقي متحرڪات کي سمجهڻ لاءِ متبادل طريقي جي طور تي ماليڪيولر ڊائنامڪس ماڊلنگ استعمال ڪيو (شڪل 8).CLMS ڊيٽا مان حوالا پيش ڪن ٿا H2B، HLA-A، ۽ HMGA1 پروٽين جي مختلف تبديلين جو امڪان.تنهن ڪري، هيٺيان امڪاني ڪمپليڪس هڪ سولوينٽ وچولي ۾ ماڊل ڪيا ويا: H2B-HLA-A، HMGA1-HLA-A، ۽ H2B-HLA-A-HMGA1.هڪ شروعاتي پروٽين-پروٽين ڊاکنگ اسڪرين استعمال ڪندي MOE ​​(ماليڪيولر آپريٽنگ ماحول؛ ڪيميڪل ڪمپيوٽنگ گروپ Inc.، مونٽريال، ڪيوبيڪ، ڪئناڊا) پيڪيج ممڪن تبديليون تجويز ڪيو جيڪي انهن پروٽينن جي وچ ۾ مختلف آهن (تصوير 8A).ڊاکنگ پروٽين جي ڪمپليڪس جي تصور کي ظاهر ڪيو ويو ڪيترن ئي ڳالهين ۽ ممڪن تبديليون (شڪل 5A، 8).اهڙيء طرح، ھڪڙي ممڪن ٺاھ جوڙ تصوير 8A ۾ ڏيکاريو ويو آھي (ليبل ٿيل ڪراس لنڪس سان) ۽ اھو وڌيڪ جائزو ورتو ويو ايم ڊي ماڊلنگ پائپ لائن استعمال ڪندي.ان کان علاوه، H2B يا HMGA1 جو HLA-A کي پابند ڪرڻ H2B جي اعلي لاڳاپي کي HLA-A لاءِ نمايان ڪري ٿو (تصوير 8A).
H2B (H2BFS) -HLA-A، HMGA1-HLA-A، ۽ H2B-HLA-A-HMGA1 ڪمپليڪس جي وچ ۾ ممڪن نيٽ ورڪن جي ٺاھڻ واري متحرڪ.(الف) کاٻي پينل هڪ 2D نقشو آهي (سِم-ايڪس ايل سافٽ ويئر ۾ ٺاهيل) intramolecular (red) ۽ intermolecular (blue) crosslinks (crosslink cutoff set to 3.5).ان کان علاوه، ڪراس سان ڳنڍڻ واري رهائش جي نشاندهي ڪئي وئي آهي H2B، HLA-A، ۽ HMGA1 پروٽين جي جوڙجڪ تي.انهن پروٽينن جي لاڳاپيل ترتيبن کي MOE ​​پيڪيج ۾ لاڳو ڪيل ڊاکنگ پائپ لائن استعمال ڪندي ڪڍيو ويو.هيٺيون کاٻي پينل ڏيکاري ٿو H2B-HLA-A ۽ HMGA1-HLA-A ڪمپليڪس جون مختلف ممڪن تبديليون مختلف پروٽين-پروٽين بائنڊنگ لاڳاپن سان (GBVI/WSA dG؛ kcal/mol).(ب) معياري انحراف (RMSD) ايٽمي پوزيشن جي (هائيڊروجن ايٽم کانسواءِ) هر پروٽين جي جوڙجڪ لاءِ.(سي) انٽرموليڪيولر پروٽين-پروٽين هائيڊروجن بانڊ جي تعاملات مختلف سميلٽيڊ ڪمپليڪسز کان خاص تعامل جي مدي کي غور ڪندي ≥ 10 ns.ايڇ-بانڊ ڊونر-قبول ڪندڙ ڪٽ آف فاصلو 3.5 Å تي مقرر ڪيو ويو، ۽ ڊونر-ايڇ-قبول ڪندڙ ڪٽ آف زاويه ≥ 160 °-180 ° تي مقرر ڪيو ويو.(D) HLA-A پروٽين-پروٽين جي لاڳاپن کي پنهنجي لاڳاپيل ڀائيوارن سان ٺهڪندڙ ليبل ٿيل رهجي ويا، ≥ 20 ns تائين، ڊمي HLA-A-H2B ۽ HLA-A-HMGA1 ڪمپليڪس مان ڪڍيا ويا.پروٽين جي جوڙجڪ 100 ns MDS جي اوسط ساخت جي نمائندگي ڪن ٿا.(E) HLA-A-H2B ۽ HLA-A-HMGA1 ڪمپليڪس جي وچ ۾ رابطي جي مقابلي ۾ H2B-HLA سموليشن ذريعي ٽريڪ ڪيل 100 ns کان وڌيڪ رابطي واري سائيٽ جي بنياد تي K يا S ٻن پيپٽائڊس جي وچ ۾.ڪمپليڪس /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.ڪراس لنڪس جي تشخيص لاء حد جي قيمت 3.0 تي مقرر ڪئي وئي، ۽ MDS کان مخصوص رابطي ≥ 10 ns وٺڻ ۾ ورتو ويو.BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) ۽ ماليڪيولر آپريٽنگ ماحوليات (MOE؛ ڪيميڪل ڪمپيوٽنگ گروپ Inc.، مونٽريال، ڪيوبيڪ، ڪئناڊا) پيڪيجز استعمال ڪندي پروٽين جي جوڙجڪ کي تصور ڪيو ويو.
HLA-A ماليڪيولز جي استحڪام وقت تي (معياري انحراف؛ RMSD يا معياري انحراف؛ RMSF) اشارو ڪيو ته ڪمپليڪس ۾ H2B يا HMGA1 پروٽين جي موجودگي HLA-A کي مستحڪم ڪيو (شڪل 8B، شڪل S5).HMGA1 پروٽين HLA-A جي B2M سائيٽ سان مضبوطي سان جڙيل آهي، HLA-A-HMGA1 يا H2B-HLA-A-HMGA1 ڪمپليڪس ۾ HLA-A امينو اسيد جي استحڪام کي وڌايو (شڪل 8B، شڪل S5).خاص طور تي، HLA باقي ~ 60-90 ۽ ~ 180-210 H2B (FIG. 8B) جي موجودگي ۾ گهٽ لچڪدار مليا ويا.H2B ۽ HMGA1 H2B-HLA-A-HMGA1 ڪمپليڪس ۾ HLA-A کي H2B يا HMGA1 اڪيلو پابند ڪرڻ جي مقابلي ۾ HLA-A سان بهتر پابند ڏيکاريا ويا (شڪل 8C، D؛ ٽيبل S5).هائيڊروجن بانڊنگ (MD ماڊل ٿيل هاءِ قبضي ≥ 10 ns) ۾ شامل رهجي ويل ڪمپليڪس ۾ CLMS رابطي واري سائيٽن (K يا S باقيات) سان ٺهڪندڙ آهن، اهو مشورو ڏئي ٿو ته CLMS پاران سڃاڻپ ڪيل رابطي تمام قابل اعتماد آهن.قابل اعتماد (تصوير 8E).CLMS ۽ MD ماڊلنگ ۾، HLA-A 190-210 ۽ اٽڪل 200-220 امينو اسيد جي وچ ۾ رهجي ويا آهن جيڪي ترتيب سان H2B ۽ HMGA1 کي پابند ڪن ٿا (FIG. 8E).
پروٽين-پروٽين جو تعامل متحرڪ ڍانچي جا نيٽ ورڪ ٺاهيندا آهن جيڪي ڪجهه محرکن جي جواب ۾ اندروني رابطي جي وچولي ڪن ٿا.ڇاڪاڻ ته ڪيتريون ئي پروٽومڪس طريقا هڪ پروٽين جي مجموعي مستحڪم رياست جي سطح ۾ تبديلين کي ڳوليندا آهن، پروٽين-پروٽين جي رابطي جي متحرڪات کي پابند انٽرفيس کي پڪڙڻ لاء اضافي اوزار جي ضرورت هوندي آهي، ۽ CLMS هڪ اهڙو اوزار آهي.انٽرفيرون سگنلنگ سسٽم هڪ سائٽوڪائن نيٽ ورڪ آهي جيڪو سيلز کي اجازت ڏئي ٿو ته هو ماحوليات جي روڪٿام ۽ اندروني پيتھولوجيڪل سگنلن جي هڪ حد جو جواب ڏين، جنهن جي نتيجي ۾ انٽرفيرون-انڊيڪيبل پروٽين جي سبسٽس جي شموليت جي نتيجي ۾.اسان CLMS لاڳو ڪيو اهو طئي ڪرڻ لاءِ ته ڇا ناول پروٽين-پروٽين جي وچ ۾ رابطي جي سڃاڻپ ٿي سگهي ٿي interferon-حوصله افزائي پروٽين جي پينل جي وچ ۾.هڪ interferon-جوابدار Flo-1 سيل ماڊل ۾ گلوبل پروٽين پار-لنڪنگ تجزيو پروٽين ڪمپليڪس کي پڪڙڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو.غير ڪراس-لنڊڪ ٿيل ۽ ڪراس-لنڊڪ ٿيل سيلز مان ٽرپٽڪ پيپٽائڊس جو اخراج پيپٽائڊ جي ڳڻپ، رستي جي افزودگي، ۽ پيپٽائيڊ ڊگھائي ورهائڻ جي اجازت ڏئي ٿو وضاحت ڪيل LFQ شدت سان.Canonical interferon-inducible پروٽين کي مثبت اندروني ڪنٽرول طور سڃاتو ويو، جڏهن ته نئين intermolecular ۽ intramolecular cross-linked addducts canonical interferon-inducible پروٽين جهڙوڪ MX1، UP18، OAS3 ۽ STAT1 ڏٺو ويو.فنڪشنل علائقن ۾ مختلف ساختماني خاصيتون ۽ رابطي جي تحقيق ڪئي وئي آهي.
HLA-A، MDN1 ۽ H2B جي وچ ۾ هڪ رابطي کي Flo-1 ۽ A549 سيلز ۾ immunoblotting ذريعي معلوم ڪيو ويو ۽ IFNα سان علاج نه ڪيو ويو.اسان جا نتيجا نمايان ڪن ٿا ته HLA-A ڪمپليڪس H2B سان IFNα-انحصار انداز ۾.اسان جو ڪم انهن ٻن ڪمپليڪس جي گڏيل لوڪلائيزيشن جي وڌيڪ ڳولا لاءِ هڪ دلچسپ رستو ڏيکاري ٿو.اهو پڻ دلچسپ هوندو ته سيل لائنن جي پينل تائين CLMS طريقي کي وڌائڻ لاء سيل-قسم-آزاد interferon-ثالث پروٽين جي رابطي کي سڃاڻڻ لاء.آخرڪار، اسان استعمال ڪيو ايم ڊي ماڊلنگ کي متبادل طريقي جي طور تي سمجھڻ لاءِ پروٽينن جي تخليقي متحرڪات کي H2BFS-HLA-A-HMGA1 ڪمپليڪس ۾ شامل ڪرڻ، جنهن کي ٽريڪ ڪيو intramolecular ۽ intermolecular cross-talk.CLMS ڊيٽا مان حوالا پيش ڪن ٿا H2BFS، HLA-A، ۽ HMGA1 پروٽين جي مختلف تبديلين جو امڪان.انهن ڊاکنگ پروٽين ڪمپليڪسز جي وچ ۾ ممڪن مختلف تبديليون ڪيترن ئي ڳالهين کي ظاهر ڪن ٿيون جهڙوڪ CLMS ڊيٽا سيٽ ۾ مشاهدو ڪيل.اسان جي طريقي جي مکيه قوتن مان هڪ اها آهي ته اها انتهائي پوليمورفڪ جينز جهڙوڪ ايڇ ايل اي جي وچ ۾ رابطي جي آسان سڃاڻپ جي اجازت ڏئي ٿي، تنهنڪري اهو دلچسپ ٿيندو ته ايڇ ايل اي هاپلوٽائپ مخصوص پروٽين جي رابطي جو مطالعو ڪرڻ لاء ٻي صورت ۾ مطالعو ڪرڻ ڏکيو آهي.گڏجي گڏ ڪيو ويو، اسان جي ڊيٽا ظاهر ڪري ٿي ته CLMS استعمال ڪري سگهجي ٿو اسان جي سمجھ کي وڌائڻ لاء interferon-induced سگنلنگ نيٽ ورڪ ۽ هڪ بنياد مهيا ڪري وڌيڪ پيچيده intercellular نظام جي مطالعي لاء tumor microenvironment.
Flo-1 سيلز ATCC کان حاصل ڪيا ويا ۽ DMEM (Gibco) ۾ رکيا ويا 1% پينسلين/اسٽريپٽومائسن (Invitrogen)، 10% fetal bovine serum (Gibco) ۽ 37°C ۽ 5% CO2 سان گڏ.انڪوبيشن.IFNα14 (ايڊنبرگ پروٽين جي پيداوار جي سهولت پاران ٺاهيل) سان علاج ڪرڻ کان اڳ سيلز 70-80٪ سنگم تائين وڌي ويا.ٻيا سڀئي ڪيميائي ۽ ريجنٽ خريد ڪيا ويا Sigma Aldrich کان جيستائين ٻي صورت ۾ نوٽ ڪيو وڃي.
Flo-1 سيلز کي 6-سٺي پليٽن ۾ ڪلچر ڪيو ويو ۽ ٻئي ڏينهن سيلز کي 10 ng/ml IFNα14 سان 24 ڪلاڪن تائين تقريبن 80٪ سنگم سان علاج ڪيو ويو.سيلز کي ٽي دفعا PBS سان ڌويو ويو ۽ تازو تيار ڪيل DSS (Thermo Fisher Scientific) (DMSO ۾ تحلیل ٿيل) PBS ۾ 5 منٽ لاءِ 37° C. تي 0.5 mM جي آخري ڪنسنٽريشن تائين ڌوئي ويو.ڊي ايس ايس ڪراس لنڪنگ رد عمل کي PBS سان تبديل ڪيو ويو ۽ بقايا ڊي ايس ايس کي 20 ايم ايم ٽريس (pH 8.0) شامل ڪندي PBS ۾ 15 منٽ لاءِ 37 ° C تي ختم ڪيو ويو.سيلز گڏ ڪيا ويا سکريپنگ ذريعي ۽ گڏ ڪيا ويا گهٽ پابند ٽيوب (Axygen) ۾.
سيل پيلٽ کي 300 µl يوريا ليسس بفر (8 ايم يوريا، 0.1 ايم ٽريس، پي ايڇ 8.5) سان 30 منٽ لاءِ ڪمري جي گرمي پد تي ڪڏهن ڪڏهن لڪڻ سان لڳايو ويو.14,000 xg تي 8 ° C تي سينٽرفيوگريشن جا سڀ مرحلا ڪيا ويا.ليسٽ کي 10 منٽن لاءِ سينٽرفيوج ڪريو ۽ سپرنيٽنٽ کي نئين ٽيوب ۾ منتقل ڪريو.باقي صاف ذرات 150 μl سيڪنڊ ليسس بفر (2 M يوريا، 2٪ (w/v) SDS (سوڊيم ڊوڊيڪل سلفيٽ)) ۾ 30 منٽ يا ان کان وڌيڪ لاءِ ان وقت تائين تحلیل ڪيا ويا جيستائين هڪ هم جنس آبي حل حاصل نه ڪيو ويو.lysate 20 منٽن لاء سينٽرفيوج ڪيو ويو ۽ supernatant کي گذريل مرحلي ۾ حاصل ڪيل lysate سان ملايو ويو.مائڪروپليٽ جي طريقيڪار لاءِ ٺاهيندڙن جي هدايتن جي مطابق مائڪرو بي سي اي (Thermo Fisher Scientific) استعمال ڪندي پروٽين جي مقدار جو اندازو لڳايو ويو.نموني کي جلدي مائع نائٽروجن ۾ منجمد ڪيو ويو ۽ -80 ° C تي محفوظ ڪيو ويو.
تقريبن 100 μg حليل ڪراس سان ڳنڍيل پروٽين کي تبديل ٿيل فلٽريشن نموني تيار ڪرڻ واري پروٽوڪول (FASP) استعمال ڪندي پروسيس ڪيو ويو جيئن بيان ڪيل Wisniewski et al.69 مختصر طور تي، پروٽين کي 200 µl يوريا بفر (0.1 M ٽريس ۾ 8 M يوريا، pH 8.5) سان ڳنڍيو ويو آهي، ڀورو ۽ اڌ ڪيو ويو آهي.14,000 xg تي 25 ° C تي سينٽرفيوگريشن جا سڀئي مرحلا ڪيا ويا.ڪراس سان ڳنڍيل پروٽين ليسٽ جو پهريون اڌ هڪ 10 kDa Microcon سينٽرفيوگل فلٽر ڊيوائس ڏانهن منتقل ڪيو ويو جيڪو هڪ الٽراسل-10 جھلي (Merck) سان ليس هو، جنهن کانپوءِ 25 منٽن لاءِ فلٽر تي سينٽرفيوگريشن ڪئي وئي.ان کان پوء پروٽين جو ٻيو اڌ فلٽر ۾ شامل ڪريو ۽ ساڳئي قدمن کي ورجايو.يوريا بفر ۾ 100 μl 17 mM tris (2-carboxyethyl) فاسفائن هائيڊروڪلورائڊ (TCEP) شامل ڪندي پروٽين جي بحالي ڪئي وئي.بحالي کي 30 منٽ لاءِ 37 ° C تي 600 rpm تي Thermomixer تي هلايو ويو.ان کان علاوه، ڪالمن کي سينٽرفيوج ڪيو ويو ۽ گهٽجي ويو ڪراس سان ڳنڍيل پروٽين کي يوريا بفر ۾ 100 μl 50 mM iodoacetamide استعمال ڪندي الڪيليٽ ڪيو ويو.alkylation ردعمل ڪمري جي حرارت تي 20 منٽن لاء اونداهي ۾ ڪيو ويو.ڪالمن کي گھمايو، ڪالمن جي ڀتين کي 3 ڀيرا 100 µl يوريا بفر سان ڌويو، ۽ پوءِ سينٽريفيوج ڪريو.ساڳيو آپريشن 3 ڀيرا ڪيو ويو 100 μl جي 100 ايم ايم امونيم بائيڪاربونٽ استعمال ڪندي.Trypsinization کان اڳ، گڏ ڪرڻ واري ٽيوب کي نئين سان تبديل ڪريو.هضمي بفر شامل ڪريو جنهن ۾ 50 ايم ايم امونيم بائيڪاربونيٽ ۽ 1 µl ٽريپسن شامل ڪيو ويو ٽريپسن بفر (پروميگا) ۾.ٽريپسن ۽ پروٽين جو تناسب تقريباً 1:33 تي برقرار رکيو ويو، ۽ هضم جي رد عمل کي رات جو 37 ° C. تي هڪ خشڪ چيمبر ۾ انڪيوب ڪيو ويو.25 منٽن لاءِ سينٽرفيوگريشن ذريعي فلٽر مان ڪراس لنڪ ٿيل پيپٽائيڊ ڪڍيو ويو.فلٽر ۾ 0.5 M NaCl جو 50 μl شامل ڪندي پيپٽائڊ جي بحالي کي بهتر ڪيو ويو، بعد ۾ 25 منٽن لاء سينٽرفيوگريشن.
C18 مائيڪرو اسپن ڪالمنز (هارورڊ اپريٽس) استعمال ڪيا ويا ڪراس سان ڳنڍيل ٽرپٽڪ پيپٽائڊس کي ختم ڪرڻ لاءِ، هيٺ ڏنل پروٽوڪول بوچل ايٽ ال.70 پاران بيان ڪيل معمولي تبديلين سان.مختصر طور تي، C18 اسپن ڪالمن کي چالو ڪيو ويو 0.1% فارمڪ ايسڊ (FA) جي ٽن واشن سان acetonitrile (AcN) (Merck) ۾ ۽ 0.1% FA جا ٻه واش.ڪالمن کي 15 منٽن لاءِ 0.1% FA سان هائيڊريٽ ڪيو ويو.نمونن کي اسپن ڪالمن ۾ لوڊ ڪريو ۽ 0.1٪ FA سان 3 ڀيرا ڌوء.ختم ٿيل پيپٽائڊس کي 0.1٪ FA ۾ 50٪، 80٪ ۽ 100٪ AcN استعمال ڪندي هڪ قدم جي ترتيب سان ترتيب ڏني وئي.نموني کي SpeedVac Plus Concentrator (Eppendorf) ۾ خشڪ ڪيو ويو جيستائين بقايا مائع مڪمل طور تي غائب ٿي وڃي.خارج ٿيل پيپٽائڊس کي 100 μl 0.08% trifluoroacetic acid ۾ 2.5% AcN ۾ ٽوڙيو ويو ۽ ڪنسنٽريشن کي NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) تي ماپيو ويو.لڳ ڀڳ 1 μg crosslinked peptide في نموني LC-MS/MS سسٽم ۾ داخل ڪيو ويو.
الٽي ميٽ 3000 RSLCnano LC سسٽم (Thermo Scientific) تي ڪراس جڙيل پيپٽائڊس جدا ڪيا ويا آھن ھڪڙي Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific) سان ڳنڍيل آھن.هڪ 300 µm ID تي ڪراس سان ڳنڍيل پيپٽائڊس گڏ ڪيا ويا، 5 mm ڊگهو µ-پري-ڪالمن C18 ڪيپچر ڪالمن سان ڀريل C18 PepMap100 sorbent ۽ 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific).پمپ فلو سيٽ لوڊ ڪريو 5 µl/min 0.08% trifluoroacetic acid dissolved in 2.5% AcN.ڪراس سان ڳنڍيل پيپٽائڊس هڪ تجزياتي فيوز ٿيل سليڪا ڪالمن تي 75 μm جي اندروني قطر ۽ 150 ملي ميٽر جي ڊيگهه سان الڳ ڪيا ويا، هڪ 2 μm PepMap sorbent (Thermo Scientific) سان ڀريل.موبائيل مرحلن A ۽ B تي مشتمل آهي 0.1% FA پاڻي ۾ ۽ 0.1% FA acetonitrile ۾.گريڊيئنٽ 2.5% B تي شروع ٿئي ٿو ۽ 90 منٽن ۾ 40% B تائين لڪيريءَ سان وڌي ٿو، پوءِ ايندڙ 2 منٽن ۾ 90% B تائين.موبائيل مرحلي جي جوڙجڪ کي 90٪ B تي 10 منٽن تائين برقرار رکيو ويو ۽ پوء 2.5٪ B تائين 2 منٽ کان پوء لڪير ۾ گھٽجي ويو.ڪالمن کي 2.5٪ B تي برابر ڪيو ويو 8 منٽن لاءِ ايندڙ چڪر کان اڳ.تجزياتي ڪالمن مان نڪتل ڪراس سان ڳنڍيل پيپٽائڊس کي نانو اليڪٽررو اسپري آئنائيزيشن (NSI) ماخذ ۾ ionized ڪيو ويو ۽ Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific) ۾ داخل ڪيو ويو.
Orbitrap Exploris 480 ماس اسپيڪٽروميٽر مثبت ڊيٽا جي رابطي واري موڊ ۾ هلائي ٿو.هڪ مڪمل اسڪين سيڪشن موڊ ۾ ڪيو ويو 120,000 جي ريزوليوشن تي رينج سيٽنگن سان m/z 350 Th کان m/z 2000 Th.عام ٿيل AGC ٽارگيٽ 300٪ تي مقرر ڪيو ويو 50ms جي وڌ ۾ وڌ ان پٽ وقت سان.peptides لاء Monoisotopic چوٽي جي ڳولا قائم ڪئي وئي آهي.پابندي واري آرام واري پيٽرولر کي صحيح طور تي مقرر ڪيو ويو آهي جيڪڏهن تمام گهٽ اڳڪٿيون مليون آهن.اڳوڻن جي گھٽ ۾ گھٽ آئنڪ طاقت 5.0e3 تي مقرر ڪئي وئي ۽ +8 تائين اڳوڻن چارج رياستن کي تجربن ۾ شامل ڪيو ويو.
ڊيٽا جي رابطي واري موڊ ۾ وڏي اسڪين جي وچ ۾ چڪر جو وقت 2.5 سيڪنڊن تي مقرر ڪيو ويو.اڳوڻن آئن جي پهرين ٽڪراءَ کان پوءِ متحرڪ ڪاميٽي خارج ڪرڻ 20 s تي مقرر ڪيو ويو.اڳوڻو اڪيلائيشن ونڊو 2th تي سيٽ ڪيو ويو.هڪ مقرر ٿيل ٽڪرائي توانائي موڊ سان معمولي ٽڪرائي توانائي جو قسم ڊيٽا تي منحصر MS/MS اسڪين ۾ چونڊيو ويو.تصادم توانائي 30٪ تي سيٽ ڪيو.Orbitrap ريزوليوشن 15,000 تي مقرر ڪيو ويو ۽ AGC ٽارگيٽ 100٪ تائين.ڪسٽم وڌ ۾ وڌ انجڻ جو وقت مقرر ڪيو ويو آهي 60 مليسيڪنڊ.
صليب سان ڳنڍيل نمونن ۾ پروٽين-پروٽين نيٽ ورڪ کي ٽريڪ ڪرڻ کان اڳ، اسان خام فائلن کي پروسيس ڪيو MaxQuant پيڪيج (ورژن 1.6.12.0) 26,27 استعمال ڪندي نمونن ۾ ڳولڻ لائق پيپٽائڊس/پروٽينن کي.ان کان علاوه، ساڳئي پروٽومڪ تجزيا ڪيا ويا اڻ ڳنڍيل Flo-1 نموني تي علاج ڪيا ويا ۽ IFNα سان علاج نه ڪيو ويو.MS/MS ڊيٽا UniProt انساني ڊيٽابيس (www.uniprot.org) ۾ ڳولها ويا (اپ لوڊ ٿيل آگسٽ 12، 2020، 75,093 داخلائن تي مشتمل آهي) بلٽ ان سرچ انجڻ Andromeda27 استعمال ڪندي.ڳولها بغير اينزيم جي خاصيت کي ظاهر ڪرڻ ۽ ڊيمميشن (N، Q) ۽ آڪسائيڊشن (M) جي مختلف ترميمن جي نشاندهي ڪئي وئي.اڳوڻو ماس رواداري 20 پي پي ايم ۽ پراڊڪٽ آئنز 0.02 Da تي مقرر ڪيا ويا.ابتدائي ۽ وڌ ۾ وڌ ڪاميٽي انحراف 10 پي ايم ايم تي مقرر ڪيو ويو.پيپٽائيڊ جو وڌ ۾ وڌ ماس 4600 Da تي مقرر ڪيو ويو ۽ تسلسل جي هڪجهڙائي 7 ۽ 25 امينو اسيد (aa) جي وچ ۾ مقرر ڪئي وئي.وڌيڪ انگن اکرن جو تجزيو Perseus پروگرام (نسخ 1.6.10.45) استعمال ڪندي ڪيو ويو.پروٽين جي مواد کي پروٽين جي اسپيڪٽرل شدت کي معمولي ڪرڻ سان حساب ڪيو ويو (LFQ شدت؛ غير ليبل ڪيل مقدار) 27 ۽ شدت جي قيمتن کي Log2 ۾ تبديل ڪيو ويو.پروٽينن جي هڪ درجي بندي ڪلسترنگ جي سڃاڻپ انهن جي پيپٽائيڊ شدت جي ذريعي ڪئي وئي هئي پيٿ ميپ (v1.0.12) پيڪيج استعمال ڪندي R (v 4.1.2).IFNα-علاج ٿيل پروٽينن لاءِ ريڪٽوم پاٿ وي ڊيٽابيس استعمال ڪندي رستي جي واڌاري جو تجزيو ڪيو ويو جيڪي غير علاج ٿيل نمونن جي مقابلي ۾ چار ڀيرا وڌيڪ چالو ڪيا ويا.
LC-MS/MS پاران نگراني ڪيل پروٽين ڪمپليڪس جي ليسين (K) يا سيرين (S) مخصوص ڪيميائي ڪراس لنڪس جي سڃاڻپ هڪ اسپيڪٽرو اسڪوپيڪ سڃاڻپ مشين (SIM-XL) ذريعي ڪراس سان ڳنڍيل پيپٽائيڊس (SIM-XL) 29 لاءِ ڪئي وئي.پهريون، انٽرفيرون سان لاڳاپيل (IFN) ڊي اين اي نقصان جي مزاحمت جي نشاني (IRDS) جين جي وچ ۾ ممڪن رابطي جي تحقيق ڪئي وئي IRDS پروٽين ڊيٽا سيٽ استعمال ڪندي بيان ڪيل Padariya et al.28.سموري انساني UniProt جي سڀني حالتن ۽ ورهاڱي جي اسڪريننگ حسابي لحاظ کان تمام گھڻي آھي، تنھنڪري سڄو انساني UniProt ڊيٽابيس (www.uniprot.org) (ڊائون لوڊ ٿيل 12 آگسٽ 2020، 75,093 داخلائن تي مشتمل آھي) IFNα-علاج ٿيل ورجائيز جي خلاف.فلٽرن مان ھڪڙو اعلي اعتماد واري رابطي لاء.اهي اعليٰ اهميت واريون ڳالهيون حاصل ڪيون ويون آهن ۽ سڀني ورهاڱي ۽ حالتن ۾ تجربا ڪيا ويا آهن.
سم-ايڪس ايل ۾، ڊي ايس ايس ڪراس لنڪر (XL) لاء استعمال ڪيو ويو ۽ XL وزن جي شفٽ ۽ ترميمي وزن جي شفٽ کي ترتيب ڏني وئي 138.06 ۽ 156.07، ترتيب سان.هيٺ ڏنل crosslinking ردعمل سائيٽن تي غور ڪيو وڃي ٿو: KK، KS ۽ KN-TERM، رپورٽر آئنز کان سواء.ٻئي اڳوڻو ۽ ٽڪرا پي پي ايم 20 تي مقرر ڪيا ويا ۽ Xrea حد مقرر ڪئي وئي 0.15 تي.ٽرپسن کي مڪمل طور تي مخصوص سمجهيو ويو، ۽ هڪ اعلي توانائي سي-ٽريپ (HCD) ٽڪنڊي جو طريقو لاڳو ڪيو ويو.XCorr متحرڪ ڊي بي جي گھٽتائي جي حد ۽ متحرڪ ڊي بي جي گھٽتائي لاء پيپٽائڊس جو گھٽ ۾ گھٽ تعداد 2.5 ۽ 2 تي مقرر ڪيو ويو، ترتيب سان.ٻيا پيرا ميٽر هي آهن: مونوسوٽوپ امڪاني ۽ چوٽي اتفاق جي ڪٽ آف، گهٽ ۾ گهٽ 4 AA باقيات في اسٽرينڊ ۽ وڌ ۾ وڌ اسٽرينڊ چارج، ۽ مس ٿيل اسپلٽس جو 3 ميڪسيما.نتيجي ۾ ٺهيل 2D نقشا (SIM-XL) ۾ تجزيو ڪيو ويو ۽ xQuest28 گرافڪ نمائندگي 2D نقشن کي تعمير ڪرڻ لاء استعمال ڪيو ويو.پروٽين جي جوڙجڪ تي پروٽينين ڪراس لنڪس PyMol ۾ مهيا ڪيا ويا آهن (PyMOL ماليڪيولر گرافڪس سسٽم، نسخو 2.0 Schrödinger, LLC).
پروٽين جي ماڊل جي جوڙجڪ Phyre2 سرور استعمال ڪندي ٺاهي وئي (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 هومولوجي ماڊلنگ جي اصولن کي استعمال ڪندي ۽ "Hidden Markov Method" تي عمل درآمد.Phyre2 ڄاڻايل پروٽين جي جوڙجڪ سان ترتيب جي ترتيب جي بنياد تي ماڊل ڍانچي ٺاهي ٿو.H2BFS، HLA-A، HMGA1، LRCH4، ۽ MDN1 پروٽين لاء، ٽيمپليٽ ڍانچي 1kx552، 1kj349، 2eze55، 6hlu62، ۽ 6i2665 استعمال ڪيا ويا.ان کان علاوه، AlphaFold71 MX1، UBP18 ۽ ROBO1 جي جوڙجڪ تي پڻ غور ڪيو ويو.پروٽين جي جوڙجڪ BIOVIA Discovery Studio Visualizer پيڪيج (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) ۽ ماليڪيولر آپريٽنگ ماحوليات پيڪيج (MOE؛ ڪيميڪل ڪمپيوٽنگ گروپ Inc.، مونٽريال، ڪيوبيڪ، ڪئناڊا) استعمال ڪندي نظر آئي.